Highly Sensitive Quantitation of N-Nitroso Timolol Impurity in Timolol API using the Agilent 6495D LC/TQ

Význam tématu

Většina N-nitrosaminů prokázala mutagenní a karcinogenní účinky, což vyvolalo zájem regulačních orgánů i výrobců léčiv. Precizní stanovení stopových hladin N-nitrosaminů v aktivních farmaceutických složkách je nezbytné pro zajištění souladu s bezpečnostními limity a ochranu pacientů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout vysoce specifickou, citlivou a reprodukovatelnou metodu pro kvantitativní stanovení N-nitroso timololu jako nečistoty v API timololu. Metoda využívá kapalinovou chromatografii spojenou s trojitým kvadrupólem (LC/TQ) k dosažení nízkých detekčních limitů a vynikající selektivity.

Použitá metodika a instrumentace

Analytické stanovení probíhalo na systému Agilent 6495D LC/TQ spojeném s Agilent 1290 Infinity II LC. Použita byla kolona Poroshell PhenylHexyl (150×3,0 mm, 2,7 μm). Mobilní fáze A obsahovala 1 mM trifluoroacetátu amonného s 0,05 % kyseliny mravenčí ve vodě, mobilní fáze B 0,1 % kyseliny mravenčí v methanolu. Gradientní program: od 55 % B po 3 minutách, následně do 75 % B, poté 90 % B a návrat k původním podmínkám. Multisampler byl chlazen na 10 °C, objem injekce 7 μL, teplota kolony 40 °C, průtok 0,4 mL/min, celkový běh 20 minut.
Pro detekci bylo použito elektronové rozprašování v pozitivním módu (AJS-ESI) se zdrojovými parametry optimalizovanými pro vysokou citlivost: teplota plynu 250 °C, teplota pláště 350 °C, kapilární napětí 3000 V, tlak mlžení 45 psi. Kvantifikace probíhala ve vícečetném monitorovacím módu (MRM) s přechody 346,2>128,0 m/z (kvantifikátor), 346,2>144,0 a 346,2>130,0 m/z (kvalifikátory).

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární rozsah metody byl potvrzen v intervalu 5–1500 pg/mL (0,5–150 ppb vzhledem k 10 mg/mL API) s koeficientem determinace R2 >0,9990 (1/x2 vážení). Detekční limit (LOD) činil 2 pg/mL (0,2 ppb) při S/N >118:1, kvantitační limit (LOQ) 5 pg/mL (0,5 ppb) při S/N >1680:1. Selectivita byla ověřena oddělením špiček API a nečistoty při retenční době 8,96 min. Meziběžná a opakovatelnost metody pro LOD, LOQ a střední koncentrace vykázaly nízké RSD (<10 %). Obnova N-nitroso timololu z API při spikování 50 pg/mL dosáhla průměrně 98,5 %, což je v rámci akceptovatelných hranic 90–110 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje spolehlivou kontrolu nečistot NDSRI v API při ultra stopových koncentracích.
• Splňuje náročné požadavky regulačních orgánů na detekci potenciálně karcinogenních látek.
• Metoda je robustní a snadno integrovatelná do rutinních QA/QC laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření podobných postupů na další API s rizikem tvorby nitrosaminů. Integrace vysokého rozlišení hmotnostní spektrometrie (HRMS) a automatické vzorkování přispěje k vyšší produktivitě a širší paletě analyzovatelných látek. Dále lze zkoumat inline monitorování procesu syntézy API.

Závěr

Vyvinutá LC/TQ metoda na Agilent 6495D/1290 Infinity II poskytuje vynikající citlivost, linearitu, selektivitu a přesnost pro stanovení N-nitroso timololu v API. Metoda splňuje požadavky regulatorních norem a je vhodná pro rutinní kontrolu kvality.

Reference

1. Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities (NDSRIs) Guidance for Industry. FDA CDER August 2023.
2. App note 5994-7066E Low-Level Quantitation of N-Nitroso Dabigatran Etexilate Impurity in Dabigatran Etexilate Mesylate API Using the Agilent 6495C LC/TQ.