Structural Characterization of Glycated Monoclonal Antibodies Using Collision Induced Unfolding on the SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS Mass Spectrometer

Význam tématu

Glykované monoklonální protilátky představují důležitou kategorii bioterapeutik, u kterých mohou post-translační modifikace ovlivnit skládání, stabilitu a účinnost léčiva. Tradiční kalorimetrické metody měření stability vyžadují velké množství vzorku a delší časy analýzy. Metoda kolizně indukovaného unfoldingu (CIU) v plynné fázi na platformě iontové mobility-hmotnostního spektrometru přináší rychlé a citlivé studium vyšší řádové struktury proteinů v prostředí bez rozpouštědla.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat aplikaci nativní iontové mobility-MS doplněné o CIU pro hodnocení skládání a stability NISTmAb před a po glykovacích reakcích s glukózou. Autoři sledovali, jak se změny v modifikačním stádiu (30 minut, 7 dní, 16 dní) promítají do plynné fáze unfoldingového profilu protilátky.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byly NISTmAb protilátky inkubovány s 1 M glukózou při 30 °C po stanovené časy, následně převedeny do 200 mM amonného acetátu a ředěny na 0,1 mg/mL. Analýza probíhala na spektrometru SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS Mass Spectrometer vybaveném nanoflow elektrosprejem. Detekce CIU zahrnovala krokové zvyšování napětí (5–200 V) v trap collision bunce a separaci rozvinutých forem ve víceprůchodové IMS.

Hlavní výsledky a diskuse

Nativní MS potvrdila postupné navyšování počtu hexózových přídavků až na více než 11 modifikací po 16 dnech glykování. CIU-otisky pro nábojový stav +25 ukázaly pět stavů skládání se čtyřmi přechody. S rostoucí mírou glykování se čtvrtý přechod stabilizoval – k úplnému unfoldingu dochází až při vyšším kolizním napětí.
Analytická CIUSuite3 umožnila:

• Porovnání CIU-otisků pomocí RMSD (intra-replikáty ~2,8 % vs. glykované vs. kontrola ~15,4 %).
• Stanovení CIU50 (inflekční bod každého přechodu) se značným posunem CIU50 pro 4. přechod z 102 V (30 min) na 148 V (16 dní).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá detekce jemných změn vyšší řádové struktury protilátek.
• Možnost vysokoprůtokového screeningu stability bioterapeutik bez nutnosti rozpustných pufrů.
• Podpora vývoje a triáže formulací či variant konstruktu v early-stage vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s automatizovanými platformami a AI-řízenou analýzou CIU-dat pro rychlejší interpretaci.
• Rozšíření na další post-translační modifikace (oxidace, deamidace) a komplexy protein–ligand.
• Spojení CIU s dalšími orthogonálními MS technikami (HDX-MS, crosslinking-MS) pro komplexní pohled na vyšší řádovou strukturu.

Závěr

CIU provedený na SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS spektrometru prokázal schopnost citlivě sledovat stabilizační vliv glykování na skládání monoklonálních protilátek. Díky rychlému workflow a softwarové podpoře CIUSuite3 lze tuto metodu využít k efektivnímu hodnocení kvality bioterapeutik během vývoje a stabilizačních studií.

Reference

1. Beveridge et al., Nat Commun. 2016;7:12163.
2. Zhao et al., Rapid Commun Mass Spectrom. 2019;33(9):894–6.
3. Zhong et al., Angew Chem Int Ed. 2014;53(35):9209–12.
4. Watanabe et al., Anal Chem. 2018;90(12):7325–31.
5. Tian et al., Anal Chem. 2015;87(22):11509–15.
6. Tian & Ruotolo, Int J Mass Spectrom. 2018;425:1–9.
7. Jeon et al., J Am Soc Mass Spectrom. 2024;35(8):1865–74.