A modified SLIM-IM-QTOF for high resolution collision induced unfolding and native protein analysis

Význam tématu

Ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) s technikou collision induced unfolding (CIU) umožňuje detailní strukturální charakterizaci naturních proteinů a protilátek. Díky vysokému rozlišení lze sledovat stabilitu proteinových komplexů a vliv ligandu.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo upravit komerčně dostupný SLIM-IM-QTOF (MOBIE® 1.0 HRIM-QTOF) přidáním in-source ionizačního aktivace hardware, a srovnat jeho výkonnost se systémem Agilent 6560 IM-QTOF pomocí CIU na modelových proteinech (BSA, HSA) a protilátkách (IgG, bsAb, tsAb).

Použitá metodika a instrumentace

• Instrument: Upravený MOBIE® 1.0 HRIM-QTOF se SLIM technologií (13 m dráha) a in-source CE hardwarem.
• Vzorky: Proteiny v 200 mM acetátu amonného, koncentrace 5–10 μM, dodávka syringovým pumpem.
• CIU: Rampování in-source kolizního napětí z 0 do 435 V, měření triplikát.
• Data: Analýza CIU fingerprintů pomocí CIUSuite 2.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání modifikovaného HRIM-QTOF a Agilent 6560 IM-QTOF na BSA/HSA ukázalo obdobnou reprodukovatelnost CIU fingerprintů (RMSD ~11–13 %). HRIM-QTOF poskytl ostřejší přechody a další strukturní funkce zejména u HSA. Dále bylo prokázáno rozlišení izotypů protilátek (IgG1 vs IgG2, κ vs λ, RMSD 3–19 %) a odlišení bispecifických a trispecifických protilátek (RMSD 7–14 %) indikující strukturální rozdíly.

Fragmenty F(ab’)2 Herceptin vs NIST mAb vykázaly výrazné rozdíly v CIU fingerprintu (RMSD ~3.5 %), kdežto intact proteiny byly podobné.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké rozlišení CIU pro sledování stability a konformačních změn proteinů.
• Efektivní screening protilátkových variant v biotechnologickém vývoji a QA/QC.
• Možnost detekce drobných strukturálních rozdílů mezi izotypy a modifikacemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k integraci dalších aktivací, automatizaci datové analýzy a rozšíření aplikací na komplexní biologické matrice. Kombinace s pokročilými metodami a AI posílí schopnost rychlé charakterizace.

Závěr

Modifikovaný SLIM-IM-QTOF s in-source aktivací ukázal srovnatelné až lepší CIU výsledky ve srovnání s konvenčním IM-QTOF. Metoda je reprodukovatelná, citlivá a vhodná pro podrobnou strukturální analýzu proteinů a protilátek.

Reference

• Gadkari, V. V. a kol., Analyst 2023, 148(2), 391–401
• Kurulugama, R. T. a kol., ASMS 2022, TP 298; ASMS 2023, ThP 395
• Polasky, D. A. a kol., Anal. Chem. 2019, 91(4), 3147–3155