A HIGHLY VERSATILE CYCLIC ION MOBILITY – MASS SPECTROMETER FOR ROUTINE TO IN-DEPTH BIOPHARMACEUTICAL CHARACTERIZATION

Význam tématu

Monoklonální protilátky vykazují výraznou strukturální rozmanitost díky různým posttranslačním modifikacím vznikajícím během výrobního procesu. Pro detailní charakterizaci jak primární, tak vyšších strukturálních úrovní se stále častěji využívá kombinace hmotnostní spektrometrie s iontovou mobilitou a kolizně indukovaného rozvinutí. Tyto přístupy umožňují měřit kolizní průřezy, rozlišovat konformační izomery a sledovat stabilitu komplexů v plynném stavu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit schopnosti nové platformy SELECT SERIES Cyclic IMS Q-TOF hmotnostního spektrometru při rutinní i hloubkové biopharma charakterizaci tří variant IgG1 monoklonálních protilátek. Studie zahrnovala subjednotkovou analýzu, peptidové mapování, analýzu uvolněných glykosidů a nativní kolizně indukované rozvinutí (CIU) pro detekci nízkomolekulárních posttranslačních modifikací a conformačních rozdílů.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: redukce DTT, odglykosylace PNGase F, alkylace iodooctanem a digesce Trypsin/LysC.
• LC-MS analýzy: top-down MSE pro subjednotky, single-pass HDMSE pro peptidové mapování, HILIC UPLC pro RFMS značené glykany.
• Nativní analýzy: výměna pufru na amonný acetát, nanospray pro native MS, iontová mobilita a CIU zpracovaná v CIUSuite 2.
• Hmotnostní spektrometrie: SELECT SERIES Cyclic IMS Q-TOF, UNIFI software pro celé workflow.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky prokázaly vysoké rozlišení až ~66 000 pro nabité stavy lehkého řetězce a 85–97 % pokrytí sekvence při peptidovém mapování. Uvolněné glykany A2G1 byly separovány na dvě chromatografické špičky odpovídající izomerům, které se dále rozlišily pomocí trojnásobného průchodu iontovou mobilitou. CIU fingerprint odhalilo odlišné rozvíjení tří variant protilátek, reflektující odlišnosti v sekvencích a disulfidových vazbách. Naměřené kolizní průřezy CCS poskytly další konfirmační údaje o supramolekulární struktuře.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma umožňuje integrální charakterizaci monoklonálních protilátek na jediné přístrojové konfiguraci. Kombinace subjednotkové analýzy, peptidového mapování, glykanové analýzy a CIU poskytuje komplexní pohled na PTM a conformační stabilitu, což usnadňuje QC, vývoj formulací a sledování stability produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v oblasti monitorování stability pod různými stresovými podmínkami (teplota, pH, mrazení/rozmrazování), rozšíření na jiné biologické molekuly a integraci pokročilých algoritmů strojového učení pro automatizaci datové analýzy a interpretace komplexních CIU fingerprintů.

Závěr

Studie potvrdila univerzálnost a výkonnost Cyclic IMS Q-TOF hmotnostního spektrometru pro rutinní i hloubkovou biopharma charakterizaci monoklonálních protilátek. Kombinace vysokého rozlišení, iontové mobility a kolizně indukovaného rozvinutí přináší bohaté strukturální informace nepostradatelné pro vývoj a kontrolu jakosti.

Reference

• Daniel A. Polasky, Sugyan M. Dixit, Sarah M. Fantin a Brandon T. Ruotolo. CIUSuite 2: Next-Generation Software for the Analysis of Gas-Phase Protein Unfolding Data. Anal. Chem. 2019, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b05762