Differentiate Minor Difference of Protein Structure in Biosimilar and Reference Products Using High-Resolution Orbitrap LC-MS/MS

Význam tématu

Analýza jemných strukturálních rozdílů mezi biosimilárními a referenčními proteinovými léky je zásadní pro zajištění jejich bezpečnosti, účinnosti a kvality. Posttranslační modifikace jako glykozylace a deamidace mohou ovlivnit farmakokinetiku, imunogenicitu a funkční vlastnosti biologik.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit workflow pro vysoce rozlišenou LC-MS/MS analýzu tří vzorků (TPA, I-TNK, G-TNK) za účelem detekce i minimálních rozdílů v glykoformách a deamidaci. Studie zahrnovala tři replikace každého vzorku a porovnání výsledných dat.

Použitá instrumentace

• Orbitrap LC-MS/MS (Q Exactive™, Thermo Scientific)
• Bench-top Orbitrap se systémem high-energy collision dissociation (HCD)

Použitá metodika

Top-ten data-dependent acquisition s kolizní energií HCD bylo aplikováno na trypticky štěpené proteiny. Každý surový datový soubor obsahoval vysoké rozlišení MS1 i MS2 spekter. Pro zpracování výsledků byl použit nový softwarový balík ve vývoji, který zajistil přesnou identifikaci a kvantifikaci glykoform a lokalizaci deamidace.

Hlavní výsledky a diskuse

• 100% proteinové sekvenční pokrytí ve všech devíti datech.
• Lokalizace dvou deamidací na zbytkách Asn-140 a Asn-142.
• Identifikace glykoform na pozicích N103, N117 a N448. Rozdílné relativní zastoupení glykanových forem mezi TPA, I-TNK a G-TNK (např. A2S2F bylo dominantní ve všech vzorcích, ostatní glykoformy vykazovaly variabilitu mezi 0,5–38 %).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje robustní a citlivou platformu pro kvalifikativní i kvantitativní srovnání biosimilárních a referenčních proteinů. Lze ji využít v kontrolách kvality (QA/QC) biologických léčiv a v regulačních procesech k ověření konzistence výrobní série.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj softwarových nástrojů pro automatizovanou interpretaci glykopeptidových dat.
• Implementace strojového učení pro predikci a rozpoznávání vzácných posttranslačních modifikací.
• Rozšíření aplikace na komplexní biologické maticové vzorky a multiplexní analýzu PTM.

Závěr

Vyvinuté LC-MS/MS workflow na bench-top Orbitrapu prokázalo vysokou citlivost a spolehlivost při detekci drobných strukturálních rozdílů mezi biosimilárním a referenčním produktem. Metoda je vhodná pro rutinní nasazení v průmyslové kontrole kvality biologik.