Combination of Bottom-Up and Top-Down Characterization of Biologics Using a High Throughput Capable Workflow in Proteome Discoverer Software

Význam tématu

V posledních letech význam proteomické analýzy biologických léčiv, zejména monoklonálních protilátek, výrazně roste. Precizní potvrzení primární struktury, identifikace modifikací a kvantifikace variant je klíčové pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a konzistence produktu během vývoje i výroby.

Cíle a přehled studie

Cílem představované studie bylo ukázat výhody kombinace bottom-up a top-down workflow v softwaru Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.0. Modelovým analytem byla monoklonální protilátka rituximab. Studie se zaměřila na:

• získání plného sekvenčního pokrytí obou polypeptidových řetězců (light/heavy),
• identifikaci glykosylace, deamidace, oxidace a dalších PTM,
• kvantitativní hodnocení relativních abundancí jednotlivých modifikovaných forem,
• posouzení truncace C-terminální lysinové zbytku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro bottom-up část byly vzorky denaturovány v 7 M močovině, redukovány DTT, alkylovány IAA a tráveny trypsinem přes noc. Digestion se zastavil kyselinou trifluoroctovou. Top-down charakterizace proběhla po buffer exchange na amonium acetát a redukci TCEP. Oddělení peptidů probíhalo na UHPLC Vanquish se C18 kolonkou Acclaim 120 (2,1×250 mm) pomocí gradientu 2–45 % ACN s 0,1 % kyseliny mravenčí. Spektrometrická data sbírala řada přístrojů Q Exactive Plus a HF vybavené módem pro velké proteiny a HESI či nanospray iontovými zdroji. Analýza proběhla v Proteome Discoverer 2.0 za pomoci uzlů Sequest HT, ProSightPD a Byonic.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Kombinací bottom-up a top-down bylo dosaženo 100 % sekvenčního pokrytí light i heavy řetězců.
2. Detekovány různé glykoformy heavy řetězce a lokalizovány deamidace, oxidace i pyroGlu konverze N-terminální Gln.
3. Relativní abundanci jednotlivých forem umožnilo kvantifikovat integrací XIC hodnot a výpočtem poměrů – truncace C-terminální lysiny činila ~4,3 %.
4. Spektrometrická dekonvoluce high-resoluce a top-down MS/MS fragmentace potvrdily drobné sekvenční odchylky i PTM s vysokou věrohodností.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace obou přístupů v jednom softwarovém prostředí zjednodušuje rutinní charakterizaci biotechnologických produktů. Získaná data podporují QA/QC procesy, vývoj formulací a studium stability i struktury terapeutických proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace workflow a integrace umělé inteligence pro rychlejší interpretaci MS dat.
• Rozšíření spektra modifikací díky novým uzlům a hybridním akvizicím.
• Vyšší průchodnost při rutinním nasazení v GMP prostředí díky zrychlené přípravě vzorku a paralelizaci analýz.
• Využití softwaru pro komplexní charakterizaci dalších tříd biologik, např. fúzních proteinů a peptidů.

Závěr

Studie demonstruje, že spojení bottom-up a top-down strategie v rámci Proteome Discoverer 2.0 poskytuje detailní a kvantitativní vhled do struktury, modifikací a heterogenity monoklonální protilátky. Výsledný postup slibuje zefektivnění kvalifikace biologických léčiv v průmyslové i akademické praxi.

Reference

1. LeDuc R.D. et al. ProSight PTM: an integrated environment for protein identification and characterization by top-down mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 2004, 32:W340–W345.
2. Durbin K.R. et al. Intact mass detection, interpretation, and visualization to automate Top-Down proteomics on a large scale. Proteomics. 2010 Oct;10(20):3589–3597.
3. LeDuc R.D., Kelleher N.L. Using ProSight PTM and related tools for targeted protein identification and characterization with high mass accuracy tandem MS data. Curr Protoc Bioinformatics. 2007 Sep;Chapter 13:Unit 13.6.
4. Zamdborg L. et al. ProSight PTM 2.0: improved protein identification and characterization for top-down mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 2007 Jul;35:W701–W706.
5. Bern M., Kil Y.J., Becker C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Curr Protoc Bioinformatics. 2012 Dec;Chapter 13:Unit 13.20.