HILIC Glycopeptide Mapping with a Wide-Pore Amide Stationary Phase

Význam tématu

Glykopeptidové mapování je klíčovou technikou pro detailní charakterizaci posttranslačních modifikací bílkovin, zejména glykozylace, která má zásadní vliv na účinnost a bezpečnost biotherapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat aplikaci HILIC separací s novou širokopórovou amidosilnou stacionární fází (Glycoprotein BEH Amide 300 Å 1,7 µm) pro mapování glykopeptidů v porovnání s konvenčními reverzními fázemi. Modelovými analyty byly tři monoklonální protilátky: trastuzumab, cetuximab a NIST referenční IgG1k.

Použitá metodika

• Příprava vzorků: neredukované Lys-C digesty a kombinované Lys-C/tryptické digesty, redukce a alkylace standardními protokoly.
• Předinjekční úprava: 80 % acetonitril + 0,1 % DMSO, centrifugace ke snížení nesoudržných složek.
• Chromatografie: gradienty 0,5 % ACN/min s 0,1 % TFA, průtok 0,2 mL/min, teplota 30–60 °C.
• Detekce: LC-UV (214 nm), fluorescenční detekce (Ex 280/Em 320 nm), MS ESI+ 50–2500 m/z.

Použitá instrumentace

• UPLC systém ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• Kolony: Glycoprotein BEH Amide 300 Å 1,7 µm 2,1×150 mm; Peptide BEH C18 300 Å 1,7 µm 2,1×150 mm
• MS: Waters SYNAPT G2-S HDMS s Q-TOF detektorem, zdroj ESI+; lockspray NaI a Glufibrinopeptid B
• Software: MassLynx V4.1, UNIFI V1.7

Hlavní výsledky a diskuse

• HILIC separace na amide kolóně poskytly orthogonální selektivitu vůči RP, výrazně lepší rozlišení hydroglykozylovaných peptidů.
• Analýza trastuzumabu prokázala detekci biantennárních a sialylovaných glykoform s vysokou přesností (<5 ppm) a citlivostí.
• Lot-to-lot variabilita glykozylace trastuzumabu byla sledována pomocí HILIC-UV, rozdíly ve frakcích FA2, FA2G1, FA2G2 korespondovaly s předchozími uvolněnými analýzami N-glykanů.
• Pro cetuximab se podařilo identifikovat více než 25 glykoform v Fc i Fab doménách, včetně imunogenních epitopů (α-1,3-gal, N-glykolylneuraminová kyselina).
• Benchmarking ukázal, že širokopórová amide kolona dosahuje špičkové kapacity až 72,8, což je o 40–96 % více než konkurenční sorbenty.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplementarita k RP peptide mappingu a k metodám uvolněných N-glykanů (RapiFluor-MS).
• MS-kompatibilita umožňuje bohatou strukturální informaci o glykoformách.
• Vhodné pro QA/QC kontrolu biopharmaceutik, lot-to-lot monitoring a vývoj biosimilars.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na analýzy intactních glykoproteinů a subjednotek.
• Integrace s ETD/HDX pro lokalizaci glykozylací.
• Automatizace a vysoce propustné formáty pro průmyslové aplikace.
• Vývoj dalších stacionárních fází pro cílené separace.

Závěr

Širokopórová amidosilná stacionární fáze Glycoprotein BEH Amide 300 Å 1,7 µm poskytuje vynikající separační výkon pro mapování glykopeptidů, nabízí orthogonální informaci k RP a umožňuje detailní charakterizaci glykoform v proteinech biopharmaceutické kvality.

Reference

1. Xie H.; Gilar M.; Gebler J. C. Anal Chem 2009, 81 (14), 5699–5708.
2. Witze E. S.; et al. Nat Methods 2007, 4 (10), 798–806.
3. Huang H. Z.; Nichols A.; Liu D. Anal Chem 2009, 81 (4), 1686–1692.
4. Lauber M. A.; et al. Anal Chem 2013, 85 (14), 6936–6944.
5. Gilar M.; Yu Y. Q.; Ahn J.; Xie H.; Han H.; Ying W.; Qian X. Anal Biochem 2011, 417 (1), 80–88.
6. Martin Gilar; et al. Waters App. Note 720003363en 2010.
7. Ahn J.; Bones J.; Yu Y. Q.; Rudd P. M.; Gilar M. J Chromatogr B 2010, 878 (3–4), 403–408.
8. Gustavsson P.-E.; Larsson P.-O. In Handbook of Affinity Chromatography; Hage D., Ed.; Taylor & Francis 2006, pp 15–33.
9. Renkin E. M. J Gen Physiol 1954, 38, 225.
10. Lauber M. A.; Koza S. M. Waters App. Note 720005385en 2015.
11. Lauber M. A.; Koza S. M. Waters Tech Brief 720005381en 2015.
12. Beck A.; Sanglier-Cianferani S.; Van Dorsselaer A. Anal Chem 2012, 84 (11), 4637–4646.
13. Yu Y. Q.; Ahn J.; Gilar M. Waters App. Note 720003576en 2010.
14. Xie H.; et al. MAbs 2010, 2 (4).
15. Houel S.; et al. Anal Chem 2014, 86 (1), 576–584.
16. Qian J.; et al. Anal Biochem 2007, 364 (1), 8–18.
17. Arnold D. F.; Misbah S. A. N Engl J Med 2008, 358 (25), 2735.