In-depth characterization of monoclonal antibodies

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčové bioterapeutikum díky své schopnosti cíleně vázat antigeny. Jejich strukturní heterogenita, způsobená posttranslačními modifikacemi (glykozylace, oxidace, deamidace), může ovlivnit biologickou aktivitu, stabilitu i bezpečnost léčiv. Detailní analýza intactní hmotnosti a dílčích fragmentů (middle-down MS) umožňuje porozumět rozložení proteoform a zajistit vysokou kvalitu finálního produktu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkonnost Orbitrap Ascend BioPharma Tribrid hmotového spektrometru pro komplexní charakterizaci trastuzumabu v jednotlivých úrovních: intactní mAb pod nativními a denaturačními podmínkami a middle-down MS analýzy subjednotek LC, HC, Fc/2 a Fd’. Vývoj metod využil různé ionizační a fragmentační techniky (ETD, EThcD, UVPD) i proton transfer charge reduction (PTCR) pro dosažení vysokého pokrytí sekvence.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky trastuzumabu byly připraveny jako: intactní mAb rozpuštěný v 50 mM amonium acetátu (nativní MS) nebo v 0,1% kyselině mravenčí (denaturační MS); subjednotky vznikaly redukcí DTT nebo trávením IdeS a následnou redukcí.

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC
• Kolony: Thermo Scientific MAbPac SEC-1 (4×150 mm), MAbPac RP (2,1×50 mm)
• MS: Orbitrap Ascend BioPharma Tribrid s možnostmi EASY-ETD, EThcD, UVPD, PTCR, Native MS
• Softwarové zpracování: Thermo Scientific BioPharma Finder 5.2

Hlavní výsledky a diskuse

Intactní analýza mAb:

• Pod nativními podmínkami (50 mM amonium acetát) dominantní náboje z = 19–30, m/z 5 000–10 000, přesnost monoisotopické hmotnosti glykoform do 6 ppm.
• Pod denaturačními podmínkami (0,1% FA/acetonitril) náboje z = 30–70, m/z 2 000–5 000, citlivost až 10 ng na injekci s přesností do 11 ppm.

Subjednotky (LC ≈23 kDa, HC ≈50 kDa, Fc/2 ≈25 kDa, Fd’ ≈25 kDa):

• Plná MS měření s rozlišením až 240 000, dekonvoluce ReSpect/Sliding Window a Xtract algoritmem, přesnost <3 ppm pro všechny subjednotky i jejich glykoformy.

Middle-down MS (ETD, EThcD, UVPD):

• ETD poskytlo sekvenční pokrytí 75–80 % pro subjednotky 20–25 kDa a 48 % pro LC/HC po přímé redukci.
• EThcD díky kombinaci ETD a HCD zvýšilo pokrytí na 84–90 % pro Fc/2, LC a Fd’ a na 58–89 % pro LC/HC.
• UVPD generovalo bohatou směs a/x, b/y, c/z fragmentů s pokrytím až 87 % (LC) a 93 % (Fc/2).

PTCR + middle-down kombinace:

• PTCR rozkládá a překoncentruje fragmenty v MS2, což vedlo k nárůstu pokrytí Fc/2 z 72 % na 80 % (EThcD) a z 66 % na 75 % (UVPD).
• Všechny surové soubory (10 runů) z EThcD, UVPD a PTCR přinesly téměř úplné pokrytí sekvence Fc/2 (98 %), vysoké LC (95–97 %) a HC (73 – 84 %).

Přínosy a praktické využití metody

Metodika nabízí:

• Vysokou přesnost hmotnosti intactních mAb i subjednotek pro QC a vývoj bioterapeutik.
• Rychlou a robustní LC-MS workflow s citlivostí do desítek nanogramů.
• Vysoké sekvenční pokrytí pro identifikaci PTM a variant proteoform.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace dalších vysokoenergetických fragmentačních technik a zdokonalené softwarové algoritmy pro auto­matizované mapování proteoform nabídnou kompletní profilování bioterapeutik. Kombinace nativních a denaturačních režimů s PTCR a AI-podpořenou analýzou dat může dále zefektivnit charakterizaci komplexních protilátek a konjugátů.

Závěr

Orbitrap Ascend BioPharma Tribrid MS v kombinaci s Vanquish Flex UHPLC představuje výkonnou platformu pro komplexní charakterizaci mAb. Díky vysokému rozlišení, široké paletě fragmentačních metod a PTCR lze detailně analyzovat intactní hmotnosti i středně velké subjednotky se sekvenčním pokrytím přes 90 %.

Reference

1. Srzentic K., Damoc E., Scheffler K. Complete characterization of monoclonal antibodies under native and denaturing conditions. Thermo Fisher Scientific Application Note 73885, 2021.
2. Srzentic K., Damoc E. Full characterization of heterogeneous antibody samples under denaturing and native conditions on the Q Exactive BioPharma mass spectrometer. Thermo Fisher Scientific Application Note 72348, 2017.
3. Kline J.T., Mullen C., Durbin K.R., Oates R.N., Huguet R., Syka J.E.P., Fornelli L. Sequential ion–ion reactions for enhanced gas-phase sequencing of large intact proteins in a Tribrid Orbitrap mass spectrometer. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2021.
4. Huguet R., Mullen C., Srzentić K., Greer J.B., Fellers R.T., Zabrouskov V., Syka J.E.P., Kelleher N.L., Fornelli L. Proton transfer charge reduction enables high-throughput top-down analysis of large proteoforms. Analytical Chemistry 2019.
5. Scheffler K., Damoc E., Bailey A., Josephs J. Enabling mass spectrometric analysis of intact proteins in native conditions of a hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer. Thermo Fisher Scientific ASMS 2016 Poster.