Soup-up AAV & LNP sample prep with Big Tuna
Aplikace | 2021 | Unchained LabsInstrumentace
Vývoj a výroba dodávacích vektorů pro genovou terapii, jako jsou lipidové nanočástice (LNP) a adeno-asociované viry (AAV), představuje náročný proces vyžadující efektivní přípravné kroky. Rychlá výměna pufrů, odstranění organických rozpouštědel a koncentrace vzorků jsou klíčové pro zachování stability, integrity nosičů a zabudované terapeutické zátěže. S narůstajícím počtem vzorků a požadavkem na vysokou propustnost vzrůstá potřeba automatizovaných, reprodukovatelných metod bez kompromisů na výtěžnosti a kvalitě vzorku.
Cílem aplikace bylo demonstrovat flexibilitu a výkonnost systému Big Tuna (Unchained Labs) pro automatizovanou výměnu pufru a koncentraci vzorků LNP, AAV a DNA. Použitím destiček Unfilter 96 a Unfilter 24 ve třech módech (Buffer Exchange, Concentrate Only, Reduce Sample Volume) byly optimalizovány protokoly pro různé vzorkové typy a objemy. Studie se zaměřila na dosažení vysoké míry výměny pufru (>96 %), cílové koncentrace a zachování integrity částic či nukleových kyselin.
Big Tuna využívá tlakově řízenou filtraci s jemným orbitálním mícháním, které zabraňuje usazování vzorků na membráně. Proces se skládá z cyklů filtrace, měření objemu a doplňování nového pufru. Uživatel volí jeden ze tří režimů:
Při LNP se používaly destičky s 100 kDa membránou, cílenou výměnou 99 % pufru a tlakem 60 psi. Pro AAV a DNA se uplatnila 30 kDa membrána, režimy Buffer Exchange s 96 % výměnou pufru a 15–60 psi.
LNP: Cílová míra výměny pufru 99 % byla překročena (99,7 %). Konečná koncentrace LNP dosáhla 83,5 µg/mL (cílově 78,4 µg/mL) a enkapsulační účinnost zůstala vysoká (96,5 % oproti původním 98 %).
AAV Buffer Exchange (Unfilter 96): Výměna pufru 97 %, finální koncentrace 2,37×10^13 cp/mL (cílově 2,38×10^13), mírná změna poměru prázdné/nabití kapsidy z 23/77 na 28/72.
AAV Buffer Exchange (Unfilter 24): Výměna pufru 96,2 %, finální koncentrace 3,13×10^13 cp/mL (cílově 2,45×10^13), poměr 36/64.
AAV Reduce Sample Volume: Dvoustupňové soustředění 36× vedlo k objemu ~524 µL (cílově 500 µL) a koncentraci 1,88×10^13 cp/mL (cílově 1,74×10^13), bez zásadní změny poměru kapsid.
DNA Desalting (Unfilter 96): Výměna 97,8 %, finální koncentrace 7,16 mg/mL (cílově 6,24 mg/mL).
DNA Desalting (Unfilter 24): Výměna 98,5 %, finální koncentrace 6,71 mg/mL (cílově 6,24 mg/mL).
Ve všech případech systém dosáhl požadovaných parametrů s minimální manuální prací a vysokou reprodukovatelností.
Automatizace buffer exchange a koncentrace zkracuje čas přípravy, minimalizuje riziko kontaminace a variabilitu mezi operátory. Vysoká propustnost až 96 vzorků současně umožňuje efektivní QA/QC a výzkumné aplikace v oblasti genové terapie, vakcín a biologických léčiv. Zachování integrity nosičů a terapeutické zátěže zajišťuje spolehlivé analytické výsledky a kvalitativní charakterizaci.
Očekává se integrace online monitorování průtoku a objemu, využití umělé inteligence pro optimalizaci parametrů a rozšíření portfolia destiček pro různé velikosti molekul. Další rozvoj může zahrnovat miniaturizaci, udržitelnější membránové materiály a kompatibilitu s mikrofluidními systémy pro ještě vyšší throughput a flexibilitu.
Systém Big Tuna představuje univerzální řešení pro vysokopropustnou výměnu pufrů a koncentraci vzorků v oblasti genové terapie. Díky přizpůsobitelným protokolům, přesnému řízení tlaku a jemnému míchání kombinuje rychlost, kvalitu a reprodukovatelnost, čímž optimalizuje přípravu LNP, AAV a nukleových kyselin pro analytické a výrobní procesy.
Příprava vzorků
ZaměřeníLipidomika, Proteomika
VýrobceUnchained Labs
Souhrn
Význam tématu
Vývoj a výroba dodávacích vektorů pro genovou terapii, jako jsou lipidové nanočástice (LNP) a adeno-asociované viry (AAV), představuje náročný proces vyžadující efektivní přípravné kroky. Rychlá výměna pufrů, odstranění organických rozpouštědel a koncentrace vzorků jsou klíčové pro zachování stability, integrity nosičů a zabudované terapeutické zátěže. S narůstajícím počtem vzorků a požadavkem na vysokou propustnost vzrůstá potřeba automatizovaných, reprodukovatelných metod bez kompromisů na výtěžnosti a kvalitě vzorku.
Cíle a přehled studie
Cílem aplikace bylo demonstrovat flexibilitu a výkonnost systému Big Tuna (Unchained Labs) pro automatizovanou výměnu pufru a koncentraci vzorků LNP, AAV a DNA. Použitím destiček Unfilter 96 a Unfilter 24 ve třech módech (Buffer Exchange, Concentrate Only, Reduce Sample Volume) byly optimalizovány protokoly pro různé vzorkové typy a objemy. Studie se zaměřila na dosažení vysoké míry výměny pufru (>96 %), cílové koncentrace a zachování integrity částic či nukleových kyselin.
Použitá instrumentace
- Systém Big Tuna s tlakově řízenou ultrafiltrací/diafiltrací (UF/DF)
- Filtrační destičky Unfilter 96 (100 kDa) a Unfilter 24 (30 kDa)
- Software Big Tuna Client pro návrh a řízení experimentů
- RiboGreen® assay a spektrofluorometr SpectraMax i3 (Molecular Devices)
- AAV kvantifikace pomocí Stunner AAV Quant
- UV/Vis spektrofotometr Lunatic (Unchained Labs)
Použitá metodika
Big Tuna využívá tlakově řízenou filtraci s jemným orbitálním mícháním, které zabraňuje usazování vzorků na membráně. Proces se skládá z cyklů filtrace, měření objemu a doplňování nového pufru. Uživatel volí jeden ze tří režimů:
- Buffer Exchange: kompletní výměna pufru s možností následné koncentrace.
- Concentrate Only: koncentrace vzorku bez výměny pufru.
- Reduce Sample Volume: paralelní koncentrace až 24 vzorků z objemu ≤48 mL na 8 mL.
Při LNP se používaly destičky s 100 kDa membránou, cílenou výměnou 99 % pufru a tlakem 60 psi. Pro AAV a DNA se uplatnila 30 kDa membrána, režimy Buffer Exchange s 96 % výměnou pufru a 15–60 psi.
Hlavní výsledky a diskuse
LNP: Cílová míra výměny pufru 99 % byla překročena (99,7 %). Konečná koncentrace LNP dosáhla 83,5 µg/mL (cílově 78,4 µg/mL) a enkapsulační účinnost zůstala vysoká (96,5 % oproti původním 98 %).
AAV Buffer Exchange (Unfilter 96): Výměna pufru 97 %, finální koncentrace 2,37×10^13 cp/mL (cílově 2,38×10^13), mírná změna poměru prázdné/nabití kapsidy z 23/77 na 28/72.
AAV Buffer Exchange (Unfilter 24): Výměna pufru 96,2 %, finální koncentrace 3,13×10^13 cp/mL (cílově 2,45×10^13), poměr 36/64.
AAV Reduce Sample Volume: Dvoustupňové soustředění 36× vedlo k objemu ~524 µL (cílově 500 µL) a koncentraci 1,88×10^13 cp/mL (cílově 1,74×10^13), bez zásadní změny poměru kapsid.
DNA Desalting (Unfilter 96): Výměna 97,8 %, finální koncentrace 7,16 mg/mL (cílově 6,24 mg/mL).
DNA Desalting (Unfilter 24): Výměna 98,5 %, finální koncentrace 6,71 mg/mL (cílově 6,24 mg/mL).
Ve všech případech systém dosáhl požadovaných parametrů s minimální manuální prací a vysokou reprodukovatelností.
Přínosy a praktické využití metody
Automatizace buffer exchange a koncentrace zkracuje čas přípravy, minimalizuje riziko kontaminace a variabilitu mezi operátory. Vysoká propustnost až 96 vzorků současně umožňuje efektivní QA/QC a výzkumné aplikace v oblasti genové terapie, vakcín a biologických léčiv. Zachování integrity nosičů a terapeutické zátěže zajišťuje spolehlivé analytické výsledky a kvalitativní charakterizaci.
Budoucí trendy a možnosti využití
Očekává se integrace online monitorování průtoku a objemu, využití umělé inteligence pro optimalizaci parametrů a rozšíření portfolia destiček pro různé velikosti molekul. Další rozvoj může zahrnovat miniaturizaci, udržitelnější membránové materiály a kompatibilitu s mikrofluidními systémy pro ještě vyšší throughput a flexibilitu.
Závěr
Systém Big Tuna představuje univerzální řešení pro vysokopropustnou výměnu pufrů a koncentraci vzorků v oblasti genové terapie. Díky přizpůsobitelným protokolům, přesnému řízení tlaku a jemnému míchání kombinuje rychlost, kvalitu a reprodukovatelnost, čímž optimalizuje přípravu LNP, AAV a nukleových kyselin pro analytické a výrobní procesy.
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
Podobná PDF
Epic Gene Therapy Tools
2021|Unchained Labs|Brožury a specifikace
Epic Gene Therapy Tools Combine and conquer Stunner is the only system that pulls together UV/Vis concentration, dynamic light scattering (DLS) and static light scattering (SLS) data from the same 2 µL sample. Dig in to your AAV by bringing…
Klíčová slova
titer, titercapsid, capsidcapsids, capsidsaav, aavhydrodynamic, hydrodynamicfull, fullssdna, ssdnadls, dlsempty, emptydiameter, diameteramplitude, amplitudesls, slstuna, tunatotal, totalaggregated
Explore AAV buffers and stability with Big Tuna and Uncle
2020|Unchained Labs|Aplikace
APPLICATION NOTE Explore AAV buffers and stability with Big Tuna and Uncle Introduction A Adeno-associated virus (AAV) vectors endure a lot of stress when exploring the unknowns of a purification process: buffer salts, pH and ionic strength all impact stability…
Klíčová slova
aav, aavtuna, tunabuffer, bufferuncle, unclebig, bigbuffers, buffersstability, stabilityexchange, exchangeaggregation, aggregationexplore, exploreexchanged, exchangedconcentrated, concentratedejection, ejectioncapsid, capsidgenome
Big Tuna
2023|Unchained Labs|Brožury a specifikace
Cut loose from manual buffer exchange Buffer exchange and sample concentration are the time consuming, hands-on chores you have to deal with before all the things you really want to do. Big Tuna is a fully automated, high-throughput buffer exchange…
Klíčová slova
unc, unctuna, tunaunchained, unchainedbig, bighai, hained, nedexchange, exchangelabs, labshain, hainbuffer, bufferrefill, refillparty, partyfreak, freaklab, labcda
Fast track formulation pH screening with automated buffer exchange on Big Tuna
2019|Unchained Labs|Aplikace
Application Note Fast track formulation pH screening with automated buffer exchange on Big Tuna Introduction The critical process of screening formulation buffers to optimize stability is labor intensive and time consuming, which are often limiting factors in biologics development. The…
Klíčová slova
tuna, tunabig, bigbuffer, bufferexchange, exchangeformulation, formulationcycle, cyclevolume, volumeprotein, proteinlabs, labsfinal, finalscreening, screeningtrack, trackaverage, averagehai, hained
