Quantification of Cy3/Cy5 labeled RNA and ssDNA

Význam tématu

Absorpční UV/Vis spektroskopie s dekonvolucí spekter je zásadní pro přesné stanovení koncentrace a označení nukleových kyselin ve výzkumu i průmyslové praxi. Metody využívající barviv Cy3 a Cy5 umožňují spolehlivě rozlišit signály cílové molekuly od nežádoucích absorbujících složek.

Cíle a přehled studie

Cílem popsané aplikace na přístrojích Lunatic a Little Lunatic je:

• Izolovat a kvantifikovat ssDNA nebo RNA označené barvivy Cy3 a Cy5 z komplexního spektra.
• Určit koncentraci nukleových kyselin a stupeň značení (DoL).
• Eliminovat vliv kontaminant jako proteiny, fenol či soli.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza je založena na aplikaci Unmix, která dekonvoluuje UV/Vis spektrum na profil cílové molekuly, profil barviv Cy3 a Cy5 a spektra nežádoucích složek. Pro instrumentaci platí:

• Lunatic systém s aplikací Unmix pro „Dyes“ sample type.
• Little Lunatic se specializovaným menu aplikací.
• Použití čisté vody jako blanku pro vyloučení rušivých absorpčních příspěvků.

Hlavní výsledky a diskuse

Unmix aplikace poskytují:

• Koncentraci ssDNA/RNA v ng/µl a pmol/µl z A260 profilu po odečtení pozadí.
• Koncentrace Cy3 a Cy5 podle jejich charakteristických absorpčních max.
• Výpočet stupně značení (DoL) poměrem molekul barviv k nukleovým kyselinám.
• Údaje o kontaminaci a parametry kvality fitu (Residuum, RRSE). Varování se spustí při zbytku >2,5 % nebo A260 <0,5 OD.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé a přesné monitorování přípravy označených nukleových kyselin pro aplikace jako qPCR, mikročipy, fluoroimaging nebo studium interakcí molekul. Eliminace vlivu kontaminant zvyšuje reprodukovatelnost a spolehlivost dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další fluorescenční barviva a multiplexní analýzy.
• Integrace se systémy správy dat a automatizace v laboratořích (LIMS).
• Pokročilé algoritmy strojového učení pro přesnější dekonvoluci komplikovaných směsí.
• Real-time monitoring a online kalibrace spektrálních sad.

Závěr

Popsaná Unmix aplikace na přístrojích Lunatic a Little Lunatic poskytuje výkonný nástroj pro kvantifikaci a hodnocení označených nukleových kyselin. Díky spolehlivé dekonvoluci spekter je možné přesně stanovit koncentrace, stupeň značení i úroveň kontaminace a zajistit vysokou kvalitu analytických dat.

Reference

Nejsou uvedeny žádné explicitní reference v původním textu.