Quantification of Glucagon-Like Peptide-1 Agonist Tirzepatide Using an Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS System

Význam tématu

Peptidová terapeutika představují rostoucí třídu léčiv s širokým uplatněním v léčbě metabolických onemocnění. Přesné stanovení čistoty a obsahu aktivních i modifikovaných forem peptidů je klíčové pro zajištění jejich bezpečnosti a účinnosti. Monitore je PTM, například oxidace tryptofanu, pomáhá odhalit potenciální degradační produkty během vývoje a skladování léků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou, citlivou a reprodukovatelnou kvantitativní metodu pro současné stanovení nepoškozené a mono-oxidované formy agonisty GLP-1 Tirzepatidu pomocí LC/MS s vícečetným monitorováním reakcí (MRM). Studie demonstruje kalibraci, určení limitů detekce a kvantifikace a ověření přesnosti a precize metody.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• Tirzepatid rozpuštěný v methanolu, kalibrační řada 0,025–250 ng/ml, QC vzorky 0,75; 7,5; 75 ng/ml
• Oxidace průkazem pomocí 2 % H2O2 při pokojové teplotě přes noc

Chromatografie a MS:

• Agilent 1290 Infinity II bio LC system s AdvanceBio Peptide Mapping column 2,1 × 150 mm, 2,7 μm, 120 Å
• Agilent 6495D triple quadrupole LC/MS s Agilent Jet Stream zdrojem
• Mobilní fáze A: 0,1 % difluoroctová kyselina (DFA) ve vodě; B: 0,1 % DFA v ACN; gradient 8 minut, 0,4 ml/min, 40 °C
• MRM přechody: kvantifikátor fragment y4 (m/z 396,3) z 5+ iontu native (m/z 1204,4) a oxidované (m/z 1208,1) formy
• Software: MassHunter Workstation acquisition LC/TQ 12.1 a quantitation software 12.1

Hlavní výsledky a diskuse

Optimální podmínky umožnily dosáhnout LOQ 0,025 ng/ml pro native a 0,25 ng/ml pro mono-oxidovaný Tirzepatid. Dynamický rozsah metody ordinoval:

• Native forma: 0,025–250 ng/ml (4 dekády, R2=0,997)
• Oxidovaná forma: 0,25–250 ng/ml (3 dekády, R2=0,996)

Precize (%CV) byla nižší než 6 % a přesnost se pohybovala mezi 81 a 115 %. Retenční časy: oxidovaná forma elutuje dříve při ~3,9 min, native při ~4,0 min. V LC chromatogramech se objevil další nízko intenzivní vrchol cizího signálu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou citlivost a reprodukovatelnost pro sledování stability peptidů v průběhu vývoje biotherapeutik. Umožňuje QC analýzu v průmyslových a výzkumných laboratořích, podporuje rozhodování o formulacích a skladovacích podmínkách.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření MRM metod pro multiplexní sledování různých PTM a degradních produktů peptidů. Integrace s vysokým propustným objemem vzorků (high-throughput) a automatizované přípravné platformy zlepší efektivitu. Kombinace kvadrupólových systémů s HRMS pro potvrzování struktur degradačních forem poskytne hlubší vhled do chemické stability bioterapeutik.

Závěr

Popsaná LC/MRM-MS metoda na systému Agilent 6495D/1290 Infinity II bio poskytuje spolehlivou kvantifikaci native a mono-oxidované formy Tirzepatidu s nízkými LOQ, širokým dynamickým rozsahem a vynikajícími parametry přesnosti a precize. Metodu lze aplikovat pro kontrolu kvality a stabilitu peptidových léčiv.

Reference

1. Müller TD, Finan B, Bloom SR et al. Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1). Mol Metab. 2019;30:72–130.
2. U.S. Food and Drug Administration. FDA Approves New Medication for Chronic Weight Management. Press Release, Nov 8 2023.
3. Suresh Babu CV. Characterization of Forced Degradation Impurities of GLP-1 Agonists by LC/Q-TOF MS. Agilent Technologies Application Note 5994-7794EN, 2024.
4. U.S. FDA. Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry. FDA Guidance, May 2018.