State-of-the-art Glycopeptide Identification Using an Orbitrap Astral Mass Spectrometer

Význam tématu

Glykozylace proteinu predstavuje klicovou posttranslacni modifikaci ovlivnujici funkci, stabilitu a interakce biologickych molekul. Precizni identifikace glykopeptidu a jejich lokalizace na proteinu jsou nezbytne pro porozumeni bunecnym signalnim cestam a mechnismum nemocneni. Vzhledem ke komplexite klinickych vzorku, jako je lidska plazma, predstavuje vysoce citliva a rychla metoda pro glykoproteomiku strategickou hodnotu pro vyzkum i diagnostiku.

Cíle a přehled studie

Cilem studie bylo demonstrovat vykon Thermo Scientific Orbitrap Astral mass spectrometru pro analýzu glykopeptidu. Autoři porovnali rychlost, citlivost a kvalitu identifikace glykopeptidu s konvencni Orbitrap Exploris 480 MS za pouziti stepped collision energy v rezimu DDA. Studie zahrnuje systematicke testy na obohacených glykopeptidech z lidske plazmy.

Použitá metodika

Vzorek lidske plazmy byl depletovan HSA a imunoglobuliny, proteiny proteiny byly denaturovany a digesovany trypsinem pomoci kitu EasyPep Maxi MS. Glykopeptidy byly obohaceny na Oasis MAX SPE sloupcich v HILIC modu. Chromatograficka separace byla provadena na Aurora Ultimate TS C18 koloně v konfiguraci Vanquish Neo UHPLC. Analýza MS/MS probehla v rezimu data dependent acquisition se stepped collision energy (jedna, dve a tri energie v serializovaném rezimu). Data byla zpracovana softwarem Protein Metrics Byonic s nastavenim presneho vyhledavani glykanove knihovny a filtrovani PSM podle Byonic score a prítomnosti glykanu.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC system
• Aurora Ultimate TS 25×75 C18 UHPLC column
• Thermo Scientific Orbitrap Astral mass spectrometer
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 MS (srovnani)
• Oasis MAX SPE sloupce pro HILIC obohaceni
• Protein Metrics Byonic v5.3.44 pro vyhledavani glykopeptidu

Hlavní výsledky a diskuse

Orbitrap Astral MS dosahuje opakovani frekvence az 200 Hz a v pripade 10 ms MS2 scan probehl az trojnásobek rychlosti oproti Orbitrap Exploris 480 MS. Pouziti dve a tri stepped collision energy vedlo k navyseni pocet identifikovanych glykopeptidu o priblizne 33 procent a zaroven ke zvyseni Byonic score. Byla identifikovana vice nez 3000 unikatnich glykopeptidu z obohacenych vzorku lidske plazmy s vyssi konfidenci lokalizace glykanu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje dramaticky zvyseny analytycky vykon pro glykoproteomiku, snizuje cas analýzy a soucasne zvýšuje hloubku pokryti a jistotu identifikace v komplexních biologickych vzorkach. Technologie je vhodna pro vysoko propustne proteomicke studie, klinickou analytiku a biomarkerovy vyzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj muze zahrnovat integraci iontove mobilitni separace, automatizaci prace s daty a kombinaci stepped collision energy s ETD pro detailnejši strukturální informaci. Ocekava se pouziti v personalizovane medicíne, rozsahle glykoproteomicke studii a rychle validaci novych biomarkeru.

Závěr

Orbitrap Astral MS s implementaci stepped collision energy ukazal vyrazne vyssi rychlost a citlivost oproti konvencni platforme, vylepsujici konfidenci identifikace glykopeptidu a posilujici potencial pro aplikace v glykoproteomice.

Reference

• M Baerenfaenger et al Maximizing Glycoproteomics Results through an Integrated Parallel Accumulation Serial Fragmentation Workflow Analytical Chemistry 96 8956 8964 2024
• H Stewart et al Parallelized Acquisition of Orbitrap and Astral Analyzers Enables High-Throughput Quantitative Analysis Analytical Chemistry 95 15656 15664 2023