Automated two step purification of 6xHis-tagged GFP

Význam tématu

Affinity chromatografie s His-tagem patří mezi nejúčinnější postupy pro separaci rekombinantních proteinů. Často je však nutné kombinovat prvotní zachycení proteinu s následnou fází čištění nebo výměny pufru, aby se dosáhlo požadované čistoty a stability. Automatizace těchto kroků významně zkracuje dobu analýzy, minimalizuje manuální zásahy a zvyšuje reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje plně automatizovaný dvoukrokový protokol purifikace 6xHis-tagovaného GFP na systému AZURA® Bio. Cílem je demonstrovat spojení affinity chromatografie na Ni–NTA kolóně s následnou velikostně-exkluzní chromatografií (SEC) pro výměnu pufru bez manuální intervence.

Použitá metodika a instrumentace

System AZURA® Bio sestával z:

• Pumpy AZURA P 6.1L HPG
• Dvou autosamplerů AZURA ASM 2.1L s 6port/3kanál ventily
• Vícevlnového detektoru MWD 2.1L (280 nm a 395 nm)
• Ventilu pro přepínání kolón, vodivostního měřiče a fraction collectoru
• Kolón Sepapure FF Ni–NTA (1 mL) pro AC a Sepapure Desalting (5 mL) pro SEC

Buffery a podmínky:

• Load/wash buffer: PBS pH 7,5 s 10 mM imidazolem
• Elution buffer: PBS pH 7,5 s 500 mM imidazolem
• Desalting buffer: PBS pH 7,4
• Průtok 1 mL/min, injekční objem 100 µL, run time 18 min

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogram ukázal pět fází protokolu: ekvilibraci, injekci lysátu, wash, eluci z Ni–NTA a gel filtraci pro výměnu pufru. Špička „flow-through“ obsahovala neznázna proteiny, zatímco GFP byl selektivně eluován v části B1 a po výměně pufru v části B2. Detekce při 395 nm potvrdila specifickou přítomnost GFP. SDS–PAGE analýza (27 kDa pás) prokázala vysokou čistotu eluovaného proteinu s minimem kontaminant.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný protokol redukuje čas a pracovní nároky díky absenci manuálního přepojování kolón a odběru vzorků mezi kroky. Vícevlnová detekce umožňuje současné sledování celkového proteinu (280 nm) a specifického GFP signálu (395 nm). Metoda je snadno adaptovatelná pro další rekombinantní proteiny či jiné affinity systémy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj směřuje k plně integrováným platformám s více chromatografickými kroky, on-line monitoringem kvality (PAT) a miniaturizovanými systémy. Kombinace s hmotnostní spektrometrií nebo automatizovaná frakční analýza rozšíří možnosti aplikací v biofarmaceutickém vývoji a kontrole kvality.

Závěr

Automatizovaná dvoukroková purifikace 6xHis-GFP na AZURA® Bio systému efektivně kombinuje Ni–NTA affinity chromatografii s gelovou filtrací pro výměnu pufru. Protokol dosahuje vysoké čistoty, zkracuje dobu analýzy a minimalizuje manuální zásahy, což představuje univerzální nástroj pro bioanalytické laboratoře.

Reference

• Maschke U., Krauke Y., Monks K. Automated two-step purification of 6xHis-tagged GFP with AZURA® Bio purification system, KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Application Note VBS0067.