Purification of p-coumaric acid esterase by immobilized metal ion affinity chromatography

Význam tématu

Hydroxycinnamové estery v buněčných stěnách rostlin zajišťují stabilitu a soudržnost polysacharidů. p-coumarátová esterase (p-CAE) je enzym schopný účinné hydrolýzy esterových vazeb mezi polysacharidy a hydroxykyselinami. Díky široké substrátové specifitě a vysoké aktivitě má p-CAE významné využití v potravinářství, farmacii a při výrobě biopaliv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat chromatografickou metodu pro purifikaci rekombinantně exprimovaného p-CAE ze systému Pichia pastoris. Provedeno porovnání dvou IMAC matic (Ni-IDA vs Ni-NTA) při dvou pH hodnotách (6 a 8) s cílem maximalizovat výtěžnost a čistotu enzymu.

Použitá metodika

Rekombinantní p-CAE byl exprimován s C-koncovým 6xHis tagem v Pichia pastoris. Protein byl adsorbován na IMAC kolony podmiňované kovovými ionty niklu. Testovány byly dvě kolonové matrice (Ni-IDA a Ni-NTA) a dva pH pufrů (20 mM fosfát pH 6 a 50 mM fosfát pH 8) s gradientní elucí imidazolem. Koncentrace proteinu určena Bradford assay a enzymová aktivita stanovena optimalizovanou reverzní fázovou HPLC metodou. Kvalitativní analýza čistoty proběhla pomocí SDS-PAGE a ošetření Endo H pro posouzení glykosylace.

Použitá instrumentace

• AZURA P 6.1L High Pressure Pump (50 mL pump head)
• AZURA P 4.1L Pump (10 mL pump head)
• AZURA UVD2.1S Single Wavelength Detector (280 nm)
• AZURA CM 2.1S Conductivity Monitor
• Foxy R1 Fraction Collector
• Bioinert Multifunction Selection Valve
• HisTrap IMAC kolony: NTA HisTrap Crude 1 mL a IDA HiTrap 1 mL
• PurityChrom5 Basic software

Hlavní výsledky a diskuse

• Nejlepší výtěžnost a čistota p-CAE byla dosažena na Ni-IDA matrici při pH 8, kde se eluce projeví jedním ostrým chromatografickým vrcholem.
• Podmínka Ni-IDA pH 8 dosáhla 35,4 % aktivního p-CAE z celkového proteinu a zaznamenala pouze 21,4 % ztrátu enzymové aktivity.
• Systémy při pH 6 a Ni-NTA vykazovaly rozdělené eluce, nižší absorpční kapacitu a mírně horší výtěžnost.
• Pro zachování deprotonovaných histidylových zbytků a optimální vazbu na nitrilotriacetanovou matrici je vhodné použít neutrální až mírně zásadité pH.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná IMAC metoda umožňuje rychlou a reprodukovatelnou purifikaci p-CAE s vysokou čistotou a výtěžností. Čistý enzym lze následně využít v potravinářské výrobě pro modifikaci rostlinných materiálů, ve farmaceutickém průmyslu a při výrobě biopaliv, například biotechnologických procesů produkce bioethanolu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace kontinuálních IMAC procesů a automatizace purifikace enzymů.
• Využití alternativních kovových iontů (Co2+, Cu2+) pro selektivní vazbu.
• Inženýrství His-tag variant pro zlepšení vazebných vlastností a specifity.
• Kombinace IMAC s dalšími chromatografickými technikami pro víceúrovňovou purifikaci.
• Rozšíření metody na purifikaci obdobných esteráz a dalších průmyslově relevantních enzymů.

Závěr

Porovnání různých IMAC systémů ukázalo, že použití Ni-IDA matrice při pH 8 poskytuje optimální kombinaci výtěžnosti, čistoty a stability p-CAE. Navržená procedura představuje efektivní a snadno implementovatelnou metodu pro získání vysoce kvalitního enzymu vhodného pro průmyslové a výzkumné aplikace.

Reference

• 1. Williamson G., Kroon P. A., Faulds C. B. Hairy plant polysaccharides: a close shave with microbial esterases. Microbiology. 1998;144(8):2011–2023. doi:10.1099/00221287-144-8-2011
• 2. Clifford M. N. Chlorogenic acids and other cinnamates – nature, occurrence, dietary burden, absorption and metabolism. J Sci Food Agric. 2000;80(7):1033–1043.
• 3. Kroon P. A., Garcia-Conesa M. T., Fillingham I. J., Hazlewood G. P., Williamson G. Release of ferulic acid dehydrodimers from plant cell walls by feruloyl esterases. J Sci Food Agric. 1999;79(3):428–434. doi:10.1002/(SICI)1097-0010(19990301)79:3 428:AID-JSFA2753.0.CO;2-J
• 4. Nieter A., Kelle S., Linke D., Berger R. G. A p-coumaroyl esterase from Rhizoctonia solani with a pronounced chlorogenic acid esterase activity. New Biotechnol. 2017;37:153–161. doi:10.1016/j.nbt.2017.01.002
• 5. Block H., Maertens B., Spriestersbach A., Brinker N., Kubicek J., Fabis R., Labahn J., Schafer F. Immobilized-metal affinity chromatography. In: Burgess R. R., Deutscher M. P., editors. Guide to protein purification. Elsevier; 2009. p.39–473. doi:10.1016/S0076-6879(09)63027-5
• 6. Gaberc-Porekar V., Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography. J Biochem Biophys Methods. 2001;49(1-3):335–360. doi:10.1016/S0165-022X(01)00207-X