Setting the start position for flexible fraction collection by using custom variables in Chromeleon CDS

Význam tématu

Automatizovaná a přesná frakční kolekce je klíčová pro purifikaci biomolekul, zejména v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu. Efektivní frakční sběr umožňuje izolovat jednotlivé složky z komplexních matric, snižovat křížovou kontaminaci a zefektivnit následné analytické či preparativní kroky.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje využití uživatelsky definovaných proměnných v systému Chromeleon CDS k nastavení libovolné počáteční polohy frakční kolekce v analyticko-preparativním LC systému Vanquish. Práce ukazuje přizpůsobitelnost frakčního sběru pro různé aplikace, včetně jednosložkového, vícesložkového a tzv. slicing módu.

Použitá instrumentace

• Vanquish System Base Horizon/Flex
• Vanquish Binary Pump F
• Vanquish Split Sampler FT (autosampler)
• Vanquish Column Compartment C
• Vanquish Diode Array Detector CG s Bio Flow Cell 2,5 µL
• Vanquish Integral Fraction Collector FT
• Kolonová vložka ProPac WCX-10, 4×250 mm, 10 µm
• Chromeleon Chromatography Data System verze 7.3.1 a novější

Použitá metodika

Pro separaci monoklonálních protilátek byla zavedena iontově výměnná UHPLC metoda s gradientem z 12 % na 95 % fosfátového pufru obsahujícího 300 mM NaCl. Vzorky mAb o koncentracích 1,5 a 15 mg/mL byly analyzovány při průtoku 1,0 mL/min, detekci při 220 nm a teplotách kolony 35 °C, autosampleru 15 °C a frakčního kolektoru 10 °C. Uživatelská proměnná „Frac_Start“ typu Text byla přidána do seznamu injekcí a v metodě do skriptu zadána jako hodnota startovací polohy kolekce.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaná metoda zajistila rozlišení hlavní frakce mAb při retenčním čase kolem 9,7 min a zachytila vedlejší kyselé a zásadité formy. Při desetinásobném zvýšení koncentrace (až 2 000 mAU) byla zachována vysoká rozlišovací schopnost. Opakovatelnost retenčních časů (RSD 0,06 %) a ploch (RSD do 0,43 %) byla pro šest replikací velmi dobrá. Vícesložková kolekce umožnila cílené sbírání čtyř oddělených zlomek s vysokou čistotou. Slicing kolekce rozdělila hlavní pik na osm 6s úseků a odhalila skryté kyselé formy, což posloužilo jako jednoduchá metoda ověření čistoty piku.

Přínosy a praktické využití metody

Flexibilita nastavení výchozí pozice kolekce prostřednictvím proměnných nabízí:

• Snadné přizpůsobení frakčního sběru různým analytickým a preparativním úkolům
• Minimální křížovou kontaminaci díky vestavěnému flush systému
• Zrychlení workflow a eliminaci manuálních zásahů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření automatizované frakční kolekce ve spojení s on-line charakterizací (MS, spektrometrie), vyšší propustnost pro screenování bioterapeutik a integrace s machine learning nástroji pro predikci optimálních sběrných oken. Dalším směrem je adaptace pro mikrofluidní formáty a paralelní frakční kolekce pro vysokokapacitní laboratoře.

Závěr

Implementace uživatelsky definovaných proměnných v Chromeleon CDS umožnila plně flexibilní a spolehlivou frakční kolekci v systému Vanquish. Metoda nabízí vysokou reproducibilitu, jednoduchou obsluhu a univerzální využití v biotechnologii a farmaceutickém výzkumu.

Reference

1. Haberger M.; Heidenreich A.-K.; Hook M.; Fichtl J.; et al. Multiattribute monitoring of antibody charge variants by cation-exchange chromatography coupled to native mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2021, 32(8), 2062–2071.
2. Koehler D.; Fabel S.; Acworth I.; Shen G.B. Thermo Scientific Technical Note 72940: Principles of fraction collection using the Vanquish HPLC and UHPLC systems, 2022.
3. Fabel S.; Acworth I.; Koehler D. Thermo Scientific Product Spotlight 001235: Separate, purify, go! Separation power paired with precise fractionation with the Vanquish Analytical Purification LC System, 2022.