Principles of fraction collection using the Vanquish HPLC and UHPLC systems

Význam tématu

Frakční sběr v HPLC a UHPLC je klíčový pro izolaci cílových látek a nečistot s vysokou čistotou a výtěžností. U systémů Thermo Fisher Vanquish HPLC/UHPLC s integrovaným Vanquish Fraction Collectorem (VFC) kombinace nízkého zpožděného objemu, přesné správy kapilár, automatizované regulace ventilu a mycích funkcí zajišťuje zachování chromatografického rozlišení i při průtocích 0,05–10 mL/min.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky je demonstrovat principy frakčního sběru na Vanquish systémech, včetně optimalizace delay volume, volby kapilár, nastavení Chromeleon CDS a využití flush a wash funkcí pro maximální čistotu frakcí a minimální carry-over.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex Analytical Purification LC: Quaternary Pump, Split Sampler FT, Column Compartment H, VWD flow cell
• Vanquish Integral Fraction Collector FT s delay kapilárou 0,1×350 mm (časová frakcionace) a 0,25×1500 mm (špičková frakcionace)
• Chromeleon CDS 7.3.1
• DNAPac RP kolona 2,1×50 mm, 4 µm

Metodika frakcionace

Oligonukleotidová směs (12–40 mer) byla separována gradientem 85–10 % A (100 mM TEAA/ACN) při 0,6 mL/min a 60 °C. Frakcionace proběhla:

• Časově řízeně: pevné okno 3,0–5,2 min bez aktivního flushu
• Špičkově řízeně: prahové a sklonné podmínky detekce s aktivním flush a wash programem pro snížení carry-over

Hlavní výsledky a diskuse

Časová frakcionace odhalila stopové nečistoty v reanalyzovaných frakcích způsobené difuzí. Špičková frakcionace s přesně změřeným delay volume (7,7 µL resp. 35,5 µL) a aktivními vyplachovacími cykly vedla k vysoké čistotě a minimálnímu carry-over. Reanalýza ukázala, že čistota izolovaných ON dosahuje >96 % (model 16 mer) a že optimalizace kapilár, softwarových parametrů a mycích režimů výrazně minimalizuje disperzi.

Přínosy a praktické využití metody

Díky nízkému delay volume a přesné synchronizaci detekce a přepínání ventilů lze:

• izolovat vysoce čisté frakce bez zkřížené kontaminace
• dosahovat vysoké návratnosti i při průtocích až 10 mL/min
• urychlit vývoj frakčních metod díky automatizované kalibraci delay volume

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace VFC s citlivou hmotnostní spektrometrií, miniaturizovanými jednotkami a pokročilou špičkovou detekcí otevírá možnosti:

• on-line zpracování komplexních biologických vzorků
• automatizovanou preparativní purifikaci biomolekul
• nasazení v HTS laboratořích pro vysokou průchodnost vzorků

Závěr

Vanquish Fraction Collector v kombinaci s Chromeleon CDS představuje účinné řešení pro analytický frakční sběr. Nízký delay volume, inteligentní mycí programy a přesné řízení přepínání ventilů zajišťují vysokou čistotu, reprodukovatelnost a vynikající recovery, což usnadňuje další analytické i preparativní postupy.

Reference

1. Gamache P.H. Nebulization. In: Charged Aerosol Detection for Liquid Chromatography and Related Separation Techniques, Wiley, 2017, s. 12–14.
2. Thermo Scientific. Vanquish Fraction Collector Operating Manual, ver. 1.0, 2022.
3. Kromidas S. et al. The HPLC Expert II, Wiley-VCH, 2017, s. 89–94.