Confident LC-MS Identification of Low ppm Host Cell Proteins (HCPs) in Biotherapeutic Monoclonal Antibodies

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčovými bioterapeutiky, přičemž přítomnost hostitelských buněčných proteinů (HCP) představuje riziko pro kvalitu a bezpečnost konečného léku. Detekce HCP na úrovni nízkých ppm je proto nezbytná pro splnění regulačních požadavků a zajištění konzistentního výkonu léčiva.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit workflow pro spolehlivou identifikaci a kvantifikaci nízkoabundantních HCP (sub-1 ppm) v preparátech mAb. K tomu autoři aplikovali netradiční non-denaturing tryptickou digesci, vysoce účinnou chromatografickou separaci a citlivou HRAM-MS detekci společně s pokročilou datovou analýzou.

Použitá metodika a instrumentace

• Non-denaturing digesce: SMART Digest™ magnetické trypsinové kuličky, 37 °C, 3 h na automatizovaném systému.
• Příprava vzorku: Koncentrace NISTmAb RM 8671 na 80 µg/µL, přidání standardních proteinů pro label-free kvantifikaci, odstranění nestráveného proteinu precipitací při 95 °C.
• UHPLC separace: Vanquish Horizon s Acclaim Vanquish C18 (2,1 × 250 mm, 2,2 µm), tok 0,3 mL/min, lineární gradient 90 min (0,1 % FA ve vodě vs. acetonitrilu), 60 °C.
• Mass spectrometrie: Orbitrap Exploris 480, dd-MS2 Top15, MS1 rozlišení 120 000, MS2 30 000, izolační okno 4 m/z.
• Software: Proteome Discoverer 2.4 s Precursor Detector a SEQUEST-HT, minimálně 2 peptidy/pro protein, 5 ppm tolerance prekurzoru, 0,02 Da fragment.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikováno přes 100 HCP s minimálně dvěma peptidy, ve dvou ze tří replikátů.
• Pokrytí abundancí od 222 ppm (fructose-bisphosphate aldolase A) po < 0,5 ppm (malate dehydrogenase a další).
• Netermální digesce omezila trávení mAb, čímž se snížil dynamický rozsah a umožnila detekce nízkých abundancí HCP.
• Výrazná reprodukovatelnost separace a spektrometrie, průměrná odchylka abundancí ze tří injekcí byla nízká.
• Snížená teplota digesce (37 °C vs. běžných 95 °C) minimalizovala degradaci mAb, zvýšila výkon analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost a schopnost spolehlivě kvantifikovat HCP na sub-1 ppm úrovni.
• Workflow kompatibilní s analytickým průtokem, vhodné pro rutinní QA/QC laboratoře v biotechnologii.
• Rozšířená dynamika měření díky vysokému rozlišení a rychlosti Orbitrap Exploris 480.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace iontové mobility pro další rozlišení komplexních směsí peptidů.
• Automatizace a vyšší propustnost vzorků s cílem zkrátit čas analýzy.
• Rozšiřování databází HCP a zdokonalování algoritmů pro zpracování chimerických spekter.
• Potenciál nasazení v dalších typech biotherapeutik a multi-omics aplikacích.

Závěr

Non-denaturing SMART Digest ve spojení s UHPLC Orbitrap Exploris 480 a pokročilou analýzou v Proteome Discoverer 2.4 umožňuje robustní identifikaci a kvantifikaci nízkoabundantních HCP pod 1 ppm. Metoda prokázala vysokou reprodukovatelnost a spolehlivost, což ji činí vhodnou pro rutinní kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Huang et al. A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies, Anal. Chem. 89(10):5436–5444, 2017.
2. Doneanu et al. Enhanced Detection of Low-Abundance Host Cell Protein Impurities in High-Purity Monoclonal Antibodies Down to 1 ppm Using Ion Mobility Mass Spectrometry Coupled with Multidimensional Liquid Chromatography, Anal. Chem. 87(20):10283–10291, 2015.