Enhanced Detection of Hemoglobin Variants in Clinical Research by DBS and High-Resolution Accurate Mass (HRAM) MS

Význam tématu

Analýza variant hemoglobinu je klíčová pro diagnostiku hemoglobinopatií a thalassemií. Konvenční elektroforetické či chromatografické metody jsou omezené v rozlišení izomerů či velmi podobných mas, přičemž detekce nových mutací zůstává výzvou. Top-down přístup využívající vysokorozlišující přesnou hmotnostní spektrometrii (HRAM MS) umožňuje přímou analýzu intactních proteoform, zlepšuje citlivost i selektivitu detekce a nabízí robustní řešení pro klinický výzkum.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo implementovat a validovat top-down LC-MS metodu pro identifikaci a kvantifikaci variant hemoglobinových řetězců zafi-xovaných ve formě suchých krevních skvrn (DBS). Studie demonstrovala rychlou přípravu vzorku v 96-well destičce, automatizovatelné extrakci proteinu a použití Orbitrap Exploris 240 MS pro vysoce přesnou analýzu proteoform.

Použitá metodika a instrumentace

Vstupní vzorek tvořil 3,2mm disk suché krevní skvrny s hemoglobinem normálním i S. Vzorky prošly přímou extrakcí a precipitací v 96-well formátu během méně než jedné hodiny. Separace proběhla na Vanquish Flex UHPLC systému s MAbPac RP kolonou (1×100 mm, 4 μm). Detekce byla realizována na Orbitrap Exploris 240 MS s BioPharma Option za použití top-down přístupu. Pro identifikaci proteoform sloužil software ProSightPD s modifikovanou databází, kvantifikace se prováděla v TraceFinderu extrakcí isotopických m/z prekurzorů.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala schopnost rozlišit varianty s rozdíly <1 Da, identifikovat mutační proteoformy a sekvenovat N-terminální modifikace. Dosah lineární kvantifikace hemoglobinu S se pohyboval od 2,5 do 100 mg/mL s R2>0,99, LOQ 2,5 mg/mL a LOD 1,0 mg/mL. Přesnost se pohybovala mezi 73–112 % a opakovatelnost pod 8 %. Výsledky potvrzují robustnost metodiky pro klinický výzkum i potenciál pro automatizaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a minimální příprava vzorku v HT formátu vhodná pro automatizaci.
• Vysoce přesná identifikace a sekvenování intactních hemoglobinových variant.
• Spolehlivá kvantifikace poměrem extrahovaných isotopických signálů.
• Automatizované zpracování dat v průmyslově dostupných softwarových nástrojích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření top-down přístupu na další proteinové biomarkery a proteoformy v různých biologických matricích. Integrace s automatizovanými robotickými systémy a implementace umělé inteligence pro data mining mohou dále zrychlit workflow. Klinické nasazení metody přispěje k personalizované medicíně a cílenému sledování léčebných intervencí.

Závěr

Předložená top-down LC-MS metoda s využitím suchých krevních skvrn a Orbitrap Exploris 240 poskytuje vysoce přesnou detekci i kvantifikaci hemoglobinových variant. Rychlá příprava, robustní výsledky a možnost plné automatizace ji řadí mezi perspektivní nástroje pro klinický výzkum a diagnostiku hemoglobinopatií.

Reference

Yvonne E. Song; Kerry Hassell; Ed Goucher; Jingshu Guo; Tanis Correa. Enhanced Detection of Hemoglobin Variants in Clinical Research by DBS and High-Resolution Accurate Mass (HRAM) MS. Thermo Fisher Scientific, 2024.