Monitoring the intact light chain of therapeutic monoclonal antibodies in human serum using an Orbitrap Exploris 240 mass spectrometer for clinical research

Význam tématu

V posledních letech roste význam terapeutických monoklonálních protilátek (mAb) v léčbě řady onemocnění. Pro přesné dávkování a monitorování účinnosti a bezpečnosti pacientů je nezbytné spolehlivě kvantifikovat koncentraci těchto protilátek v lidské krvi. Vzhledem k vysoké strukturní podobnosti terapeutických mAb a endogenních imunoglobulinů představuje přesná analýza výzvu, kterou lze překonat využitím vysokorozlišené hmotnostní spektrometrie intact subunit přístupu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo vyvinout workflow pro cílenou kvantifikaci intaktních lehkých řetězců terapeutických mAb v lidské séru pomocí Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240. Metoda využívá selektivní purifikaci Protein L magnetickými kuličkami, on-beads štěpení proteázou IdeS a redukci disulfidických vazeb, následovanou UHPLC separací subjednotek a HRAM Orbitrap analýzou.

Použitá metodika a postup

Postup sestává z těchto klíčových kroků:

• Příprava vzorku: 10 μL lidské séra inkubované s Protein L magnetickými kuličkami.
• On-beads IdeS digesce a disulfidická redukce přímým přidáním reagencií, což eliminuje potřebu dalších elučních kroků.
• Desalting a koncentrace subjednotek přes ultrafiltrační destičku (10 kDa).
• UHPLC separace Fd’, lehkého řetězce a Fc/2 subjednotek na MAbPac RP kolonu při 80 °C.
• HRAM MS analýza s Orbitrap Exploris 240 ve full-scan režimu pro kvantifikaci lehkého řetězce.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Exploris 240 MS s BioPharma Option
• Thermo Scientific Vanquish Flex Binary UHPLC
• MAbPac RP HPLC kolona (2,1 × 50 mm, 4 μm)
• Thermo Scientific Pierce Protein L magnetické kuličky
• Genovis IdeS proteáza (FabRICATOR)
• Thermo Scientific TraceFinder 5.1 software pro data akvizici a vyhodnocení

Hlavní výsledky a diskuse

Vývoj metody odhalil limity detekce 1–5 μg/mL a linearitu R2 > 0,99 pro všechny testované mAbs (adalimumab, bevacizumab, camrelizumab, daratumumab, golimumab, rituximab). Optimalizace Orbitrap rozlišení (>120 000) výrazně zlepšila rozlišení izotopických oblaků v komplexním sérovém pozadí. On-beads postup minimalizoval ztráty vzorku a zkrátil dobu přípravy na méně než 1,5 hodiny. Test reproducibility použití dvou šarží kolony ukázal posuny retenčních časů < 0,2 min a rozdíly v peak area < 20 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje nízkoodběrový režim (10 μL séra), rychlou a jednotnou přípravu vzorku, selektivní purifikaci kappa lehkých řetězců a robustní kvantifikaci intact protein subunit. Je vhodná pro terapeutický monitoring mAb (TDM) v klinických laboratořích, kde tradiční imunologické metody mohou selhávat kvůli interferencím endogenních imunoglobulinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na simultánní monitorování lehkých a těžkých řetězců intact mAb.
• Automatizace na mikrofluidní platformě pro vyšší propustnost.
• Aplikace metody na jiné proteinové modality (Fab fragmenty, bispecifické protilátky).
• Integrace interních standardů snadno dostupných mAbs pro širší panel protilátek.

Závěr

Vyvinutá metoda pro intact light chain kvantifikaci mAb v lidském séru poskytuje spolehlivou, rychlou a vysoce specifickou alternativu k peptidové analýze. Vysoké rozlišení Orbitrap Exploris 240, Protein L purifikace a on-beads chemie umožňují přesné stanovení koncentrace mAb v klinických vzorcích s minimálním objemem séra a krátkou přípravou.

Reference

1. Lu RM a kol. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science 2020;27.
2. Antibody Drugs: Technologies and Global Markets, 2021.
3. Marin C a kol. Cross-validation of a multiplex LC-MS/MS method for assaying mAbs plasma levels in patients with cancer: A GPCO-UNICANCER study. Pharmaceuticals 2021;14:796.
4. Cradic KW a kol. Vedolizumab quantitation using high-resolution accurate mass–mass spectrometry middle-up protein subunit: method validation. Clin Chem Lab Med 2020;58:864.