The Analysis of Human Haemoglobin Variants using Mass Spectrometry

Význam tématu

Analýza lidských variant hemoglobinu (Hb) má zásadní význam pro diagnostiku a sledování hemoglobinopatií, jako jsou srpkovitá anémie či talasémie. Přesná identifikace mutací globinových řetězců (α, β, δ, γ) umožňuje včasné stanovení rizika závažných onemocnění, cílenou genetickou konzultaci a volbu léčby.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem publikace je představit metodiku rychlé a robustní identifikace variant Hb pomocí hmotnostní spektrometrie s elektrosprejem (ESI-MS) a tandemovou MS (ESI-MS/MS). Studie shrnuje pět klíčových kroků od standardního nálezu varianty klasickými technikami (ce-HPLC, IEF) až po potvrzení mutace na úrovni peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky krve jsou 500× ředěny v 50% vodno-acetonitrilovém pufru s 0,2% kyselinou mravenčí.
• Odstranění solí pomocí kat-iontového pryskyřice (Bio-Rad AG50W-X8).
• ESI-MS analýza čistých α- a β-řetězců na trojpólovém hmotovém analyzátoru (VG/Micromass Quattro Ultima).
• In-silico kalibrace m/z škály interními α-řetězci; dekonvoluce MaxEnt.
• Rychlá 30minutová trypsinizace na pH 8 bez chromatografie; přímá ESI-MS analýza směsi peptidů.
• Tandemová MS pro sekvenování peptidů s mutací a identifikaci hybridních Hb.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intaktní analýza řetězců dosahuje přesnosti lepší než ±0,05 Da, umožňuje detekci variant s posunem hmoty o 1 Da až od abundance 10 % v heterozygotech.
• Desalting zlepšuje rozlišení δ-řetězce (Hb A₂) a snižuje interference Na/K aduktů.
• α/β řetězce s posunem hmoty <6 Da jsou přiřazeny kombinací m/z odchylky β-řetězce a polarity změny z ce-HPLC.
• Tryptické peptidy (αT1–αT14, βT1–βT15) identifikují polohu mutace ve 2×15 polích, přičemž ~50 % mutací je rozpoznáno přímo díky unikátním hmotnostem peptidů.
• Zbývajících ~50 % mutací vyžaduje ESI-MS/MS sekvenaci mutačního peptidu, což dokumentují příklady více než dvaceti známých mutací i hybridů.
• Metoda efektivně odhalí hybridní formy Hb (Lepore, Kenya, P-Nilotic) bez potřeby genotypování.

Přínosy a praktické využití metody

• Doba analýzy: <2 h od příjmu vzorku po zprávu; vysoká propustnost pro klinické laboratoře.
• Univerzální postup bez nutnosti specifických protilátek, odlišných sond nebo PCR.
• Možnost identifikovat „tiché“ varianty neodhalené konvenčními elektroforetickými metodami.
• Kvalifikovaná kalibrace a kvalitní kontrolní standardy zajišťují reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorků a vysokorozlišovací MS (Orbitrap, TOF) pro vyšší citlivost a rozlišení izotopů.
• Multiplexní workflow pro simultánní sledování přes 50 mutací a modifikací (glykované, glutathionylace).
• Integrace s bioinformatickými databázemi (HbVar) a AI-návrhmi pro predikci nových variant.
• Využití ve screeningových programech v oblastech s vysokou prevalencí hemoglobinopatií.

Závěr

Popisovaná ESI-MS/ESI-MS/MS metodika přináší rychlý, citlivý a vysoce přesný nástroj pro identifikaci lidských hemoglobinových variant. Kombinace intaktní analýzy řetězců, selektivní trypsinizace a sekvenace peptidů umožňuje díky minimální přípravě vzorků vysoce efektivní rozlišení stovek mutací i hybridů. Tento přístup vhodně doplňuje klasické chromatografické a elektroforetické techniky a otevírá nové možnosti pro klinickou diagnostiku a výzkum.