Improved Sensitivity for Trifluoroacetic Acid Gradients on the Alliance™ iS HPLC Systems

Význam tématu

Trifluoroctová kyselina (TFA) je často používána jako iontově párací činidlo při reverzní fázi HPLC biochemických analýz, zejména aminokyselin a peptidů. Díky značné UV absorpci při nízkých vlnových délkách (<220 nm) a částečnému zadržování na stacionární fázi mohou při graduálních metodách vznikat fluktuace základní čáry (baseline ripples), které negativně ovlivňují citlivost a přesnost kvantifikace. Řešení těchto problémů je klíčové pro validované postupy v regulovaných laboratořích a průmyslu biochemické analytiky.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkon USP monografie pro organické nečistoty tryptofanu (Procedure 1) na systémech Alliance iS HPLC a Alliance iS Bio HPLC. Metoda zahrnuje gradient s 0,1 % TFA ve vodě a v acetonitrilu a detekci při 220 nm. Systémy byly porovnány ve výchozí konfiguraci (standardní beaded mixer) a s volitelným titanovým diffusion bonded mixerem. Dále byl otestován vliv různých objemů zdvihu pístu (stroke volume) na poměr signál/šum.

Použitá metodika a instrumentace

Pro experimenty byly využity tyto přístroje a komponenty:

• HPLC systémy Alliance iS a Alliance iS Bio (quaternární solvent manager, programovatelné stroke volume).
• Beaded mixer (standardní 675–680 µL) a optional diffusion bonded mixer (690 µL, mikrofluidní kanálky v titanu) pro efektivnější míchání.
• Column: XBridge C18, 5 µm, 4,6 × 250 mm; teplota 30 °C.
• Detektor: tunabilní UV (TUV), vlnová délka 220 nm; vzorkovací frekvence 5 bodů/s.
• Mobilní fáze A: 0,1 % TFA ve vodě; B: 0,1 % TFA v 80:20 acetonitril/voda.
• Gradient: lineární nárůst fáze B o 1,7 %/min při průtoku 1,0 mL/min.
• Systém pro sběr dat: Empower 3 CDS.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve výchozí konfiguraci obou systémů s beaded mixerem bylo dosaženo přijatelných hodnot RSD pro plochu a retenci (<5 %), avšak základní čára vykazovala zřetelné fluktuace. Nasazení diffusion bonded mixeru vedlo k 8–18násobnému zlepšení poměru signál/šum a snížení RSD plochy z 1–2 % na <0,5 %. Nejlepší výsledky vykázal systém Alliance iS Bio s diffusion bonded mixerem a polovičním objemem zdvihu, kde kombinace vyšší homogeneity míchání a častějších pumpovacích cyklů významně stabilizovala základní čáru.

Přínosy a praktické využití metody

Nasazení optimalizovaného diffusion bonded mixeru přináší následující výhody:

• Výrazné potlačení základních čar a snížení šumu v TFA gradientu.
• Vyšší citlivost a lepší limit detekce při nízkých koncentracích nečistot.
• Zlepšená reprodukovatelnost plochy špiček v regulovaných monografiích.
• Možnost okamžité integrace do validovaných postupů v QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k miniaturizaci mixerů pomocí pokročilých mikrofluidních technologií, optimalizaci povrchových úprav kapalinových cest pro redukci nespecifické adsorpce biomolekul a integraci inteligentních algoritmů pro predikci a kompenzaci baseline driftu v reálném čase. Využití těchto inovací v kombinaci s AI‐podporovanou analýzou může zásadně zlepšit přesnost a rychlost biofarmaceutických analýz.

Závěr

Diffusion bonded mixer pro systémy Alliance iS a Alliance iS Bio HPLC prokázal významné snížení šumu a fluktuací základní čáry při TFA gradientu při 220 nm. Nejlepší citlivost a přesnost integrace bylo dosaženo na systému Alliance iS Bio s polovičním objemem zdvihu pístu. Implementace této konfigurace umožňuje spolehlivou analýzu nízkokoncentrovaných nečistot tryptofanu podle USP monografie a nabízí širší využití v biofarmaceutické kvalitativně‐kvantitativní analýze.

Reference

1. Jennifer Simeone, Paula Hong. Peptide Mapping using Binary Biocompatible LC Systems: Evaluation of Retention Time Precision and Mixing Effects on Waters and Competitive LCs. Waters Application Note 720007078, 2021.
2. United States Pharmacopeia. USP Monographs Tryptophan Organic Impurities (Procedure 1). USP-NF, 2023.
3. Ti Diffusion Bonded Mixer – 690 µL Kit Installation Guide. Waters Corporation 715009251, 2024.
4. Fabrice Gritti. Thermodynamic Interpretation of the Drift and Noise of Gradient Baselines in Reversed-Phase Liquid Chromatography Using Mobile Phase Additives. Journal of Chromatography A 1633 (2020) 461605.