COMPARISON OF MIXER PERFORMANCE FOR HPLC METHODS UTILIZING TFA GRADIENTS

Význam tématu

Správné míchání mobilní fáze v gradientní reverzní fázi HPLC s trifluoroctovou kyselinou (TFA) je zásadní pro stabilní baseline, reprodukovatelné retenční časy a vysokou citlivost analýzy zejména při detekci pod 250 nm, kde TFA silně absorbuje.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkonnost tří různých mixérů v kombinaci s dvěma typy HPLC systémů: konkurentním vysokotlakým binárním System X a nízkotlakým kvaternárním Waters Alliance iS. Vyhodnocena byla přesnost retenčních časů a poměr signál/šum při analýze organických nečistot tryptofanu.

Použitá metodika

Byla aplikována USP metoda pro stanovení organických nečistot tryptofanu s gradientem TFA–acetonitril. Gradient probíhal dle monografie při nízké vlnové délce (<250 nm), aby byly zohledněny interference způsobené TFA.

Použitá instrumentace

• HPLC systémy: System X (vysokotlaký binární) a Waters Alliance iS (nízkotlaký kvaternární).
• Mixéry: 400 μL statický mixer (System X), 675 μL standardní nerezový perlový mixer (Alliance iS) a 690 μL titanový mikrofluidní difuzně vázaný mixer (Waters Part #205002590).

Hlavní výsledky a diskuse

• System X se 400 μL mixérem vykazoval výraznou baseline ripple a nižší poměr signál/šum.
• Alliance iS se standardním 675 μL mixérem dosáhl mírného zlepšení, ale baseline šum zůstal patrný.
• Použití 690 μL titanového mikrofluidního mixéru vedlo k výraznému snížení šumu a baseline ripple. Poměr signál/šum se zvýšil přibližně 7× oproti 675 μL mixeru a 2× oproti konfiguraci System X.
• Přesnost retenčních časů byla u všech konfigurací srovnatelná.

Přínosy a praktické využití metody

Díky optimalizaci mixéru lze dosáhnout stabilnější baseline, lepší detekční meze a vyšší reprodukovatelnosti analýz iontově párovaných a kyselých sloučenin. To umožňuje spolehlivější stanovení stopových nečistot v biotechnologických a farmaceutických aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj mikrofluidních mixérů s vysokou kapacitou pro aplikace s rychlými gradienty a vyššími průtoky.
• Integrace inteligentních řídicích algoritmů pro dynamické přizpůsobení složení mobilní fáze v reálném čase.
• Výzkum nových materiálů odolných vůči agresivním mobilním fázím a vysokým tlakům pro dlouhodobou stabilitu mixéru.

Závěr

Výběr vhodného mixéru má zásadní dopad na kvalitu gradientních HPLC analýz s TFA. Titanový 690 μL mikrofluidní difuzně vázaný mixer ukázal největší redukci baseline ripple a nejvyšší zvýšení poměru signál/šum, aniž by byla ovlivněna přesnost retenčních časů.

Reference

1. Hong P a Simeone J Deciding Between Quaternary and Binary Systems Waters Corporation 2019
2. United States Pharmacopeia USP Monographs Tryptophan USP-NF Rockville MD USP 2024
3. Ti Diffusion Bonded Mixer 690 μL Kit Installation Guide Waters Corporation Milford MA USA 2024