HPLC Analysis of Phosphorylated Peptides on the Alliance™ iS Bio System with MaxPeak™ High Performance Surface (HPS) Technology - A System Designed for Bioseparations

Význam tématu

Peptidová mapování a analýza fosforylovaných peptidů jsou klíčovými nástroji v monitorování kvality léčiv a v řízení kritických parametrů procesu (CQA). Fosfátové skupiny mají silný záporný náboj a snadno vytvářejí nežádoucí ne-specifické adsorpce (NSA) na kovových površích HPLC systémů, což vede k problémům jako zhoršené rozlišení, protahování píků, ztráta signálu a snížená přesnost plochy píků. Moderní bio-inertní konstrukce s ochrannými povrchy, například MaxPeak HPS, slouží k omezení těchto interakcí a tím zvyšují spolehlivost analýz v regulovaných i výzkumných laboratořích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat výkonnost HPLC systému Alliance iS Bio vybaveného MaxPeak HPS technologií s jiným bio-inertním systémem (označeno jako System X) a s klasickým nerezovým (stainless-steel) HPLC systémem při analýze čtyř standardizovaných fosfopeptidů (tři mono‑fosforylované: t18p, t19p, t43p a jedna di‑fosforylovaná: t43pp). Hodnoceny byly metriky citlivé na NSA a pumpní přesnost: doby zadržení (retention time), přesnost plochy píků (area % RSD), tvar píků (USP tailing) a úroveň šumu. Vzorky byly analyzovány v šesti opakováních, aby se hodnotila opakovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda a materiál

• Standarda: Waters MassPREP Phosphopeptide Standard Enolase (obsahuje čtyři fosforylované peptidy), rekonstituováno v mobilní fázi A; vzorky uchovávány v QuanRecovery MaxPeak HPS polypropylenových vialkách pro omezení vazby.
• Opakování: n = 6 injekcí pro každou sérii na každém systému.

Chromatografické podmínky

• Systémy: Alliance iS Bio HPLC System (s MaxPeak HPS), Bio-inert HPLC System X, Legacy stainless-steel HPLC System.
• Column: XSelect Premier Peptide CSH C18, 130 Å, 2.5 µm, 4.6 × 100 mm.
• Mobilní fáze A: 0.1 % TFA ve vodě; mobilní fáze B: 0.1 % TFA v acetonitrilu.
• Flow rate: 0.500 mL/min; objem injekce: 25 µL; teplota kolony: 60 °C; teplota vzorku: 5 °C.
• Detekce: UV 214 nm; datová rychlost: 5 Hz.
• Další parametry: needle wash a seal wash 90/10 voda/ACN; chromatografický software: Empower 3.8.0.1.

Instrumentační poznámky

• Alliance iS Bio má quaternární pumpu s menším zdvihem pístu (stroke volume) a integrovaným in-line mixerem; MaxPeak HPS vytváří bariérovou vrstvu minimalizující interakce s kovovým oxidem podložky.

Hlavní výsledky a diskuse

Shrnutí pozorovaných efektů

• Šum: Alliance iS Bio vykázal nejnižší USP šum ~3.9 × 10-5 µAU; Bio‑inert System X a stainless‑steel systémy měly vyšší průměrné šumy ~1.8 × 10-4 a 1.7 × 10-4 µAU. Nižší šum na Alliance je částečně připisován in-line mixeru a menšímu pumpnímu zdvihu, což redukuje baseline ripple při TFA gradientu.
• Přesnost retenčních časů: Všechny systémy měly RT standardní odchylky <0.02 min; Alliance dosáhl nejlepší opakovatelnosti s max RT SD = 0.003 min, System X a stainless‑steel dosáhly max 0.010 a 0.016 min.
• Tvar píků (USP tailing): U mono‑fosforylovaných peptidů byly výsledky podobné napříč systémy. U di‑fosforylovaného t43pp bylo výrazně horší chování na nerezovém systému (vyšší tailing a větší SD), což indikuje významnější NSA na kovových površích.
• Přesnost plochy (area % RSD): Pro t18p, t19p, t43p měla Alliance nejvyšší přesnost (<0.4 % RSD). Pro t43pp měly bio-inertní systémy podobné plochy a area % RSD <2.5 %, zatímco nerezový systém vykázal výrazně sníženou výšku i plochu piku (přibližně 1/3 výšky oproti bio systémům) a area % RSD = 7.9 %.

Interpretace

• Výsledky potvrzují, že MaxPeak HPS a další bio-inertní konstrukce snižují NSA fosfopeptidů, což se projeví lepšími plochami píků, menším tailingem pro citlivé analyty a vyšší opakovatelností.
• Pumpní design (nižší stroke volume a in-line mixer) významně přispívá ke stabilnějšímu baseline při plynných gradientních programech s TFA a k lepší přesnosti retenčních časů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená spolehlivost analýz fosforylovaných peptidů v regulovaných laboratořích díky omezení NSA, zlepšení přesnosti ploch (lepší kvantifikace) a konzistentnímu tvaru píků pro identifikaci CQA.
• Možnost použití při dlouhých, plochých gradientních rozlišeních pro peptidové mapování bez časté pasivace nebo opakovaných úprav povrchů.
• Výhodné pro workflowy zahrnující LC‑UV a LC‑MS, kde ztráty signálu způsobené adsorpcí na kovových površích snižují citlivost a reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší adopce bio-inertních povrchů (MaxPeak HPS a ekvivalenty) v laboratorní technice pro analýzy biologicky citlivých molekul, včetně fosfoproteomiky a QC biotechnologických produktů.
• Integrace těchto systémů s citlivějšími detektory (HRMS) pro zvýšení recoveries a hloubky detekce fosforylací bez nutnosti časově náročné pasivace.
• Další vylepšení pumpních modulů (nižší dead volume, optimalizované míchání) směřující k minimalizaci baseline ripple při agresivních gradientních programech a lepší reprodukovatelnosti.
• Vývoj nových povrchových úprav a materiálů, které kombinují chemickou inertnost s mechanickou odolností a kompatibilitou s širokým spektrem mobilefází.

Závěr

Studie ukazuje, že Alliance iS Bio HPLC systém s MaxPeak HPS technologií poskytuje zlepšenou analytickou výkonnost při analýze fosforylovaných peptidů ve srovnání s legacy nerezovými systémy a je srovnatelný nebo lepší než jiné moderní bio-inertní platformy. Hlavní přínosy zahrnují snížení NSA, nižší šum, vynikající přesnost retenčních časů a lepší opakovatelnost ploch píků, zejména u peptidů s vysokou afinitou k metalickým povrchům. Tyto vlastnosti jsou zvláště hodnotné v prostředích vyžadujících vysokou spolehlivost a reprodukovatelnost analytických dat.

Reference

1. Walter TH, Trudeau M, Simeone J, Rainville P, Patel AV, Lauber M, Kellett J, DeLano M, Brennan K, Boissel C, Birdsall RE, Berthelette K. Low Adsorption UPLC Systems and Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces: The Acquity Premier Solution. Waters White Paper. 2021.
2. Koshel BM, Simeone J, Dao D, Nguyen JM, Rzewuski SC, Lauber M, Birdsall RE, Yu YQ. Bypassing LC System Passivation Requirements Using Acquity Premier with MaxPeak HPS Technology for the Recovery of a Phosphorylated Peptide. Waters Application Note. 2020.
3. Hughes C, Gethings LA, Plumb RS. Maximizing Phosphopeptide Recovery in LC-MS Studies with MaxPeak High Performance Surfaces Technology. Waters Application Note. 2020.
4. Martin K, Gauthier L, Hong P. Improved Sensitivity for Trifluoracetic Acid Gradients on the Alliance iS HPLC Systems. Waters Application Note. 2024.
5. Alliance iS HPLC System Specification Sheet. Waters. 2025.