Monitoring Impurities Using a High Throughput Focused Gradient With the Alliance™ iS Bio System

Význam tématu

Peptidové mapování a monitorování oxidovaných forem proteinů jsou klíčové pro zajištění kvality a bezpečnosti monoklonálních protilátek. Rychlé a citlivé HPLC-UV metody v QC laboratořích zkracují dobu analýzy a zvyšují spolehlivost detekce stopových nečistot.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a přenést vysoce průchodný zaměřený gradient z RPLC-MS metody na UV-detekční metodu na systému Alliance iS Bio HPLC. Jako modelový analyzát sloužil trypticky digesovaný standard NISTmAb s peptidem T21 a jeho oxidovanou formou.

Použitá metodika

• Příprava mobilních fází s 0,1 % difluoroctanovou kyselinou (DFA) pro optimalizaci tvaru špiček a minimální iontové potlačení.
• Vývoj zaměřeného gradientu z 80 na 20 minut pro rychlou a selektivní separaci původního a oxidovaného peptidu.
• Škálování objemu injekce (10–100 µl) a stanovení lineárního rozsahu pomocí kalibračních křivek.
• Testování stability základní čáry při 49 prázdných injekcích a reproducibility 17 vzorků během 30 hodin.

Použitá instrumentace

• Alliance iS Bio HPLC System s 690 µl Titanium diffusion bonded mixer a integrovaným vzorkovacím čerpadlem pro objemy až 100 µl.
• Arc Premier System s 680 µl mixerem, detektorem 2489 TUV a ACQUITY QDa II Mass Detector.
• Kolona XSelect Premier Peptide CSH C18 (4,6×100 mm, 2,5 µm, 130 Å), teplota 60 °C, vzorková vana 10 °C.
• Software Empower 3 CDS pro řízení, zpracování a reportování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Zkrácený 20minutový gradient zcela oddělil peptid T21 a jeho oxidovanou formu s vysokou spektrální čistotou.
• Difluoroctanová kyselina poskytla optimalizovaný tvar špiček a dostatečnou citlivost pro UV-detekci.
• Titanový diffusion bonded mixer významně snížil šum základní čáry, což zvýšilo spolehlivost detekce stopových nečistot.
• Objem injekce až 100 µl vykázal vynikající linearitu mezi hmotností peptidu a plochou špičky (R² ≅ 1).
• Stabilita oxidované formy T21 během 30hodinového měření: průměrný obsah ≤ 2 % a %RSD ≅ 12 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká průchodnost a rychlost analýzy přizpůsobená rutinnímu QC.
• Spolehlivá detekce nízkoabundantních nečistot bez externích injekčních smyček.
• Přímý přenos metody z MS do UV detekce s minimální optimalizací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace hmotnostní spektrometrie pro potvrzení identity špiček přímo během analýzy.
• Vývoj pokročilejších mixerů a mobilních fází pro zvýšení citlivosti a reprodukovatelnosti.
• Automatizace QC workflow pomocí pokročilých CDS a umělé inteligence.
• Rozšíření aplikace na další biotechnologické produkty, např. bispecifické protilátky.

Závěr

Alliance iS Bio HPLC System poskytuje rychlou, citlivou a vysoce reprodukovatelnou metodu pro monitorování peptidových nečistot v proteinových léčivech pomocí UV detekce. Optimalizace pomocí DFA, diffusion bonded mixeru a velkoobjemové injekce minimalizuje šum a zvyšuje spolehlivost výsledků, čímž se zefektivňuje provoz QC laboratoří.

Reference

1. Nyugen JM, Liu X, Lauber MA. Comparing Mobile Phase Additives for the Separation of mAb Tryptic Peptides: A Case Study on Formic, Difluoroacetic, and Trifluoroacetic Acid. Waters Application Note 720006681, 2019.
2. Han D, Birdsall RE, Nyholm K. Migrating Peptide Mapping Methods from the Arc Premier System to the Alliance iS Bio System with Gradient SmartStart Technology and Intelligent Method Translator App. Waters Application Note 720008443, 2024.
3. Birdsall RE, Du X, Nyholm K. Extending the Analytics of Biopharmaceutical QA/QC Labs with the ACQUITY QDa II Mass Detector. Waters Application Note 720008386, 2024.
4. Martin K, Gauthier L, Hong P. Improved Sensitivity for Trifluoroacetic Acid Gradients on the Alliance iS HPLC Systems. Waters Application Note 720008550, 2024.
5. Waters User Manual. Ti Diffusion Bonded Mixer - 690 µL Kit Installation Guide. 715009251, 2024.