In-Depth Characterization of Monoclonal Antibodies Using Intact Mass Analysis and Middle-down Approaches on Orbitrap Ascend BioPharma Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Hloubková charakterizace monoklonálních protilátek je klíčová pro ověření jejich bezpečnosti, účinnosti a konzistence v biotechnologickém sektoru. Metody určení přesné molekulové hmotnosti a sekvenční pokrytí jednotlivých podjednotek umožňují detailní analýzu variant proteinu a posttranslačních modifikací.

Cíle a přehled studie

Studií byla ověřena výkonnost hmotnostního spektrometru Thermo Scientific Orbitrap Ascend BioPharma Tribrid pro:

• Intaktní analýzu mAb v nativních i denaturačních podmínkách
• Middle-down přístupy zahrnující štěpení na podjednotky Fc/2, lehký řetězec (LC) a Fdʼ
• Porovnání fragmentačních technik ETD, EThcD, UVPD a PTCR

Použitá metodika a instrumentace

Pro intaktní měření byly využity:

• UHPLC Vanquish Flex s SEC-1 kolónou pro nativní separaci (50 mM amonného octanu)
• MAbPac reverse phase kolóna pro denaturační režim (0,1 % kyseliny mravenčí)
• Orbitrap Ascend BioPharma Tribrid MS s rozlišovací schopností až 240 000

Pro middle-down analýzy:

• Enzymatická štěpení IdeS
• Redukce TCEP/DTT
• Fragmentace ETD, EThcD, UVPD a následné snížení náboje PTCR

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní analýza:

• Mass accuracy < 3 ppm pro nativní i denaturační podmínky
• Rozlišení glykovaných forem při různých koncentracích od 10 ng do 1 µg

Middle-down analýza:

• Více než 98 % sekvenčního pokrytí pro Fc/2 a Fdʼ subjednotky při kombinaci EThcD/UVPD/PTCR
• LC dosáhl až 97 % pokrytí, HC více než 73 % při sloučení dat z více replikací
• EThcD a UVPD poskytly větší množství fragmentů než samotné ETD, PTCR dále zlepšilo čitelnost spekter

Přínosy a praktické využití metody

Metoda dovoluje:

• Rychlou a přesnou kontrolu kvality bioterapeutik
• Detailní mapování PTM a variant struktur mAb
• Optimalizaci výrobních procesů a validaci formulací

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Automatizace vysokopropustných analýz a integrace s robotickými systémy
• Rozšíření middle-down technik o nové fragmentační přístupy (např. ECD–UVPD hybridní metody)
• Uplatnění strojového učení pro predikci PTM a interpretaci složitých spekter

Závěr

Orbitrap Ascend BioPharma Tribrid MS spolu s kombinací ETD, EThcD, UVPD a PTCR poskytuje vysoce přesné a komplexní řešení pro intaktní i middle-down charakterizaci monoklonálních protilátek. Metoda nabízí téměř úplné sekvenční pokrytí klíčových podjednotek a splňuje požadavky moderní bioprodukce a QC laboratoří.

Reference

1. Srzentic K, Damoc E, Scheffler K a kol. Complete characterization of monoclonal antibodies under native and denaturing conditions. Thermo Fisher Scientific Application Note 73885 (2021).
2. Scheffler K, Damoc E. Full characterization of heterogeneous antibody samples under denaturing and native conditions on the Q Exactive BioPharma mass spectrometer. Application Note 72348 (2017).
3. Kline JT, Mullen C, Durbin KR a kol. Sequential Ion–Ion Reactions for Enhanced Gas-Phase Sequencing of Large Intact Proteins in a Tribrid Orbitrap Mass Spectrometer. JASMS 32(9):2334–2345 (2021).
4. Huguet R, Mullen C, Srzentic K a kol. Proton Transfer Charge Reduction Enables High-Throughput Top-Down Analysis of Large Proteoforms. Analytical Chemistry 91(24):15732–15739 (2019).
5. Scheffler K, Damoc E, Bailey A, Josephs J. Enabling Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins in Native Conditions on a Hybrid Quadrupole-Orbitrap. ASMS Poster (2016).