Ultrafast Quantitation of Immunosuppressant Drugs in Whole Blood by Agilent 6475 LC/MS

Význam tématu

Imunosupresivní léky jako takrolimus, sirolimus, everolimus a cyklosporin A vyžadují důsledné sledování koncentrací v krvi pacientů po transplantaci, aby se maximalizovala účinnost terapie a minimalizovalo riziko nefrotoxicity a neurotoxicity. Rychlá a citlivá analýza těchto látek podporuje klinické rozhodování a zvyšuje průchodnost vzorků v diagnostických laboratořích.

Cíle a přehled studie / článku

Popisovaná aplikace představuje ultrarychlou (2,5 min) kvantifikaci čtyř imunosupresivních látek v celkové krvi pomocí Agilent 6475 triple kvadrupolního LC/MS a soupravy RECIPE ClinMass TDM. Studie se zaměřila na validationní parametry: citlivost, linearitu a mezidení reprodukovatelnost při použití standardních a kontrolních vzorků.

Použitá instrumentace

ULCI/MS systém byl tvořen:

• LC modul: Agilent 1290 Infinity II (binární pumpa G7120A, multisampler G7167B, termostat G7116B)
• MS modul: Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS s Agilent Jet Stream zdrojem

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky se připravují jednoduchou precipitací: 100 µL homogenizované krve se smíchá s 220 µL přidaného interního standardu a precipitantu, agituje se na Geno/Grinderu (5 min, 1 200 rpm), inkubuje 5 min při pokojové teplotě a poté se odstředí (10 000 rpm, 5 min). Supernatant (20 µL) se vstřikuje do LC/MS. Metoda využívá gradientní eluční program (0–95 % mobilní fáze B) při průtoku 0,9 mL/min, kolona RECIPE (MS9032/MS9030) při 70 °C. Kvantifikace je založena na MRM přechodech optimalizovaných v MassHunter, pozitivní ionizace.

Hlavní výsledky a diskuse

Limit detekce se pohyboval od 0,38 do 6,78 µg/L v závislosti na analytu. Kalibrační křivky vykazovaly vynikající linearitu (R² > 0,996) v rozsazích:

• Takrolimus: 0,39–13,4 µg/L
• Sirolimus: 0,43–14,3 µg/L
• Everolimus: 0,38–13,9 µg/L
• Cyklosporin A: 6,78–395,3 µg/L

Mezidení (n=3 dny) přesnost koncentrací QC vzorků byla 93–113 % a relativní standardní odchylka < 6,5 %. Při ultrarychlém běhu nebylo pozorováno významné přenášení („carryover“).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Extrémně krátký čas analýzy (2,5 min na vzorek) umožňující >500 vzorků/den
• Vysokou citlivost a specifitu díky MRM režimu
• Zjednodušenou přípravu bez nutnosti složitého čištění

To zajišťuje efektivní nasazení v klinických laboratořích pro terapeutické monitorování (TDM).

Budoucí trendy a možnosti využití

Další optimalizace by mohla zahrnovat automatizovanou přípravu vzorků a rozšíření panelu sledovaných imunosupresiv. Nasazení vyspělých softwarových nástrojů pro zpracování dat a integrace do laboratorních informačních systémů dále zvýší efektivitu.

Závěr

Vyvinutá ultrarychlá LC/MS metoda umožňuje spolehlivou a citlivou kvantifikaci čtyř klíčových imunosupresant v celkové krvi. Jednoduchá příprava a vysoká průchodnost vzorků ji činí vhodnou pro klinické i výzkumné aplikace v oblasti terapeutického monitorování.

Reference

1. Yeung P. Mass Spectrometry Quantitation of Immunosuppressive Drugs in Clinical Specimens Using Online Solid-Phase Extraction and Accurate-Mass Full Scan–Single Ion Monitoring. J. Mass Spectrom. Adv. Clin. Lab. 2023, 99–104.
2. Gunay G. Simultaneous Analysis of Tacrolimus, Sirolimus, Everolimus, and Cyclosporine A in Whole Blood Using an Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS. Agilent Technologies Application Note 5994-2395EN.