Native Mass Spectrometry of Membrane Protein-Ligand Complexes Using the SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS

Význam tématu

Membránové proteiny tvoří významnou část proteomu a jsou primárními cíli pro léčiva. Jejich analýza v přirozeném stavu je však náročná kvůli nutnosti zachování lipofilních oblastí v micelárních prostředích, která komplikují hmotnostní spektrometrii.

Cíle a přehled studie

Tato práce představuje využití hmotnostního spektrometru SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS pro nativní analýzu membránových proteinů. Cílem je:

• Optimalizovat uvolnění proteinů z detergentních micel bez destrukce struktury.
• Změřit kolizní průřezy (CCS) složených proteinů pomocí cyklické iontové mobility.
• Ukázat aplikaci pro screening drogových ligandů na modelových proteinech OmpF a pfMATE.

Použitá metodika a instrumentace

Pro nativní MS byly proteiny rozpouštěny v roztocích amonného acetátu s vhodnými detergenty nad kritickou micelární koncentrací (β-OG pro OmpF, C8E4 pro pfMATE). Detergentní micely byly odstraněny kolizní aktivací v zdroji a v kolizní komoře.

• Výkonný hmotnostní spektrometr SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS
• Možnost nastavení zdrojového kuželového napětí a kolizních napětí v pasti pro declustering
• Cyklická iontová mobilita pro sledování kolizního průřezu a monitorování unfoldingu
• Nástroj IMScal pro kalibraci CCS hodnot

Hlavní výsledky a diskuse

1. Proteom OmpF (111,2 kDa) s 1% β-OG:
   při nízké energii spektrum dominovaly signály detergentních clusterů
   po zvýšení kuželového a pastového napětí (150/200 V) došlo k efektivnímu odstranění detergentů, což umožnilo přesné stanovení molekulové hmotnosti a CCS (6 380 ± 52 Å2 pro 21+).
2. Proteom pfMATE (50,5 kDa) s 0,5% C8E4:
   optimalizace napětí (160/6 V) zajistila vysoké rozlišení (Rp=70 000), isotopické rozlišení a CCS (3 655 ± 20 Å2 pro 10+).
   inkubace s knihovnou 133 sloučenin odhalila ligand 372 Da v 1:1 stechiometrii ukazující schopnost přímého screeningu komplexních směsí.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká kvalita nativních hmotnostních spekter membránových proteinů
• Rychlá optimalizace declusteringu a zachování přirozené struktury díky IMS
• Možnost přímé detekce a identifikace malých ligandů v komplexních směsích
• Podpora screeningových workflow pro farmaceutický výzkum

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s dalšími analytickými technikami (kryo-EM, NMR) pro komplexní strukturální charakterizaci
• Rozšíření screeningů na fragmentové knihovny a chemicky rozmanité sady sloučenin
• Vývoj měkkých kolizních protokolů pro studium křehkých komplexů protein-ligand
• Automatizace datového zpracování CCS a stechiometrie komplexů

Závěr

SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS představuje výkonné a flexibilní řešení pro nativní MS membránových proteinů. Kombinace silné kolizní aktivace s cyklickou iontovou mobilitou umožňuje detailní analýzu molekulové hmotnosti, struktury a ligandového vázání. Tento přístup významně podporuje výzkum a vývoj v oblasti farmaceutických cílů.

Reference

1. Errey JC, Fiez-Vandal C. Protein Expression and Purification. 2020;169:105569.
2. Reading E et al. Angew Chem. 2015;127(15):4660–4.
3. Housden NG et al. Science. 2013;340(6140):1570–4.
4. Richardson K et al. Anal Chem. 2021;93(7):3542–50.