EXPANDING NATIVE MASS SPECTROMETRY CAPABILITIES FOR SOLUBLE AND MEMBRANE PROTEINS USING A QUADRUPOLE-ION MOBILITY-TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETRY SYSTEM

Význam tématu

Native hmotnostní spektrometrie (MS) umožňuje studium proteinových komplexů a membránových proteinů v jejich přirozeném stavu, což je klíčové pro pochopení struktury, funkce a interakcí biomolekul. Schopnost určit kolizní průřezy (CCS) a mapovat topologii komplexů usnadňuje výzkum v proteomice, farmaceutickém vývoji a strukturní biologii.

Cíle a přehled studie

Cílem předložené studie je demonstrovat rozšířené možnosti systému SELECT SERIES Cyclic IMS pro native MS, konkrétně:

• provádění komplex-down experimentů pro sekvenování proteinu streptavidinu,
• vysokorychlostní separaci konformérů a určení TWCCSN2 hodnot,
• analýzu membránových proteinů OmpF a pfMATE v přítomnosti detergentních micel,
• automatizované řízení Surface Induced Dissociation (SID).

Použitá metodika a instrumentace

Všechna měření proběhla na systému SELECT SERIES Cyclic IMS vybaveném:

• ESI zdrojem (borosilikátové nanokapiláry, napětí na elektrodě z Pt vodiče),
• před-IMS SID zařízení a ExD buňkou (elektronově zachycovací dissociace),
• trapovací kolizní buňkou pro CID (kolizní indukovaná disociace),
• cyklickým iontovým pohybem (TWIMS) s kalibrací CCS pomocí nástroje IMScal19 (polyalanin, BSA),
• softwarovým balíčkem waters_connect včetně modulu IMScal a ProSight Lite pro analýzu top-down dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Komplex-down experimentech na tetrameru streptavidinu (53 kDa) vedly k uvolnění monomerů, jejich selekci (7+ nabití) a následné CID/ECD fragmentaci. ECD dosáhla 78 % pokrytí, CID 89 %, kombinace 98 %.
Ionická mobilita umožnila oddělení produktů disociace podle tvaru a náboje, což usnadnilo přiřazení fragmentů se stejným m/z.
Membránové proteiny OmpF (110 kDa trimer) a pfMATE (50 kDa) byly úspěšně zbaveny detergentních micel (β-OG, C8E4) kolizní aktivací v zdroji a trap buňce. Získané CCS hodnoty 6380 Å2 (OmpF, 21+) a 3655 Å2 (pfMATE, 10+) odpovídají očekávaným referencím.
Automatizace SID umožnila rychlou akvizici SID profilů pro streptavidin (11+), přičemž rostoucí napětí vedlo k přechodu distribuce fragmen­tů od tetramer–dimer–monomer.

Přínosy a praktické využití metody

Nová platforma poskytuje:

• vysoké rozlišení konformérů a přesné CCS určení,
• bohatou škálu fragmentačních režimů (CID, ECD, SID) pro top-down analýzu,
• efektivní analýzu i náročných membránových proteinů,
• zvýšenou produktivitu díky automatizované SID akvizici.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj integrace SID do rutinních analytických protokolů, rozšíření softwarových nástrojů pro automatizaci komplexních workflow a aplikace v průmyslové proteomice, strukturální virologii a screeningových platformách léčiv.

Závěr

Systém SELECT SERIES Cyclic IMS významně rozšiřuje schopnosti native MS analýz, nabízí vysoce flexibilní fragmentační módy a vysoké rozlišení iontové mobility. Umožňuje detailní studium proteinových komplexů i membránových proteinů v jejich „native“ stavu s vysokou přesností CCS a komplex-down sekvenováním.

Reference

• Richardson K., Langridge D., Dixit S.M., Ruotolo B.T. Anal. Chem. 2021, 93(7): 3542–3550.
• Fellers R.T., Greer J.B., Early B.P., Yu X., LeDuc R.D., Kelleher N.L., Thomas P.M. Proteomics 2015, 15(7): 1235–1238.
• Gadkari V.V., Rojas Ramirez C., Vallejo D.D., Kurulugama R.T., Fjeldsted J.C., Ruotolo B.T. Anal. Chem. 2020, 92(23): 15489–15496.