Accurate Collision Cross Sections From Traveling Wave Ion Mobility Measurements in Native Mass Spectrometry – A Structural Investigation of Cas9 Ribonucleoprotein Complexes

Význam tématu

Ion mobility spektrometrie založená na traveling wave (TWIMS) je zásadní technikou pro získávání prostorových informací o biologických makromolekulách v jejich nativním stavu. Kolizní průřez (CCS) slouží jako kvantitativní ukazatel tvaru iontu a umožňuje sledovat konformace proteinů, agregaci či interakce s nukleovými kyselinami.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem application note je představit snadno použitelné softwarové řešení IMScal pro kalibraci TWIMS na přístrojích Waters a přesné stanovení CCS hodnot. Experiment zahrnuje validaci kalibrace na standardních proteinech a následné měření CCS pro Cas9 endonukleázu a její ribonukleoproteinový komplex (RNP) se syntetickou průvodní RNA (sgRNA).

Použitá metodika a instrumentace

Kalibrace byla provedena pomocí standardního setu polyalaninových peptidů a bovinního sérového albuminu s referenčními CCS stanovenými na driftové hybnosti. Vzorky (streptavidin, concanavalin A, Cas9, sgRNA) byly připraveny v 200 mM roztoku acetátu amonného a analyzovány nanoselektrosprávou v režimu pozitivní ionizace. Pro měření CCS byly pořízeny jednopravé průchody cyklickým TWIMS separátorem.

Použitá instrumentace

• Select Series Cyclic IMS mass spectrometer (Waters Corporation)
• Nanolockspray zdroj s statickou jehlou
• Software MassLynx™ v4.2 a Driftscope™ v3.0
• Kalibrační nástroj IMScal s grafickým uživatelským rozhraním

Hlavní výsledky a diskuse

Ověření kalibrace na streptavidinu a concanavalinu A potvrdilo shodu CCS hodnot s referenčními daty v odchylce menší než 0,3 %. U Cas9 bylo naměřeno CCS 7893 ± 119 Å2, u sgRNA 2280 ± 13 Å2. Po inkubaci Cas9 s jednou sgRNA vznikl komplex s CCS 8573 ± 170 Å2, přičemž druhá vazba sgRNA vedla k novému komplexu o CCS 9891 ± 202 Å2. Výsledky naznačují, že první sgRNA se usazuje většinově v dutině proteinu, zatímco druhá může v in vitro podmínkách vázat méně specificky.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a přesné stanovení CCS pro široké spektrum biomolekul
• Vysoká kvalita dat s minimem nejednoznačností v nativní MS
• Možnost detailního studia RNP komplexů klíčových pro vývoj genových terapií

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace kalibrace a integrace s pokročilým zpracováním dat
• Spojení s in silico modelováním pro hlubší strukturální analýzy
• Rozšíření použití v QA/QC biofarmaceutik, zejména CRISPR/Cas systémů
• Studium dynamiky a interakcí dalších biomolekulárních komplexů

Závěr

Implementace IMScal společně s vysoce výkonným Select Series Cyclic IMS přístrojem umožňuje spolehlivé a přesné měření kolizních průřezů v nativní hmotnostní spektrometrii. Metoda poskytuje cenné strukturální informace o Cas9 a jeho vazbě na sgRNA, čímž podporuje další rozvoj analytiky v oblasti genové terapie.

Reference

1. Sahin C, Motso A, Gu X et al. Mass Spectrometry of RNA-Binding Proteins during Liquid–Liquid Phase Separation Reveals Distinct Assembly Mechanisms and Droplet Architectures. J Am Chem Soc. 2023;145(19):10659–68.
2. Harrison JA, Pruška A, Bittner P et al. Advancing Cyclic Ion Mobility Mass Spectrometry Methods for Studying Biomolecules: Toward the Conformational Dynamics of Mega Dalton Protein Aggregates. Anal Chem. 2022;94(36):12435–43.
3. Bush MF, Hall Z, Giles K et al. Collision Cross Sections of Proteins and Their Complexes: A Calibration Framework and Database for Gas-Phase Structural Biology. Anal Chem. 2010;82(22):9557–65.
4. Richardson K, Langridge D, Giles K. Fundamentals of Travelling Wave Ion Mobility Revisited: I. Smoothly Moving Waves. Int J Mass Spectrom. 2018;428:71–80.
5. Richardson K, Langridge D, Dixit SM, Ruotolo BT. An Improved Calibration Approach for Traveling Wave Ion Mobility Spectrometry: Robust, High-Precision Collision Cross Sections. Anal Chem. 2021;93(7):3542–50.
6. Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 2014;513(7519):569–73.
7. Sehnal D, Bittrich S, Deshpande M et al. Mol* Viewer: modern web app for 3D Visualization and Analysis of Large Biomolecular Structures. Nucleic Acids Res. 2021;49(W1):W431–7.
8. Zheng X, Kurulugama RT, Laganowsky A, Russell DH. Collision-Induced Unfolding Studies of Proteins and Protein Complexes using Drift Tube Ion Mobility-Mass Spectrometer. Anal Chem. 2020;92(10):7218–25.