An Introduction to Ion-Paired Reverse-Phase Oligonucleotide Separations: From Analysis to Purification

Význam tématu

Ion-párovaná reverzní fáze (IP-RP) představuje klíčovou chromatografickou metodu pro separaci oligonukleotidů v analytickém i preparativním měřítku. Díky schopnosti rozlišit drobné modifikace, fail sequence i délkové varianty nabízí vysoké rozlišení v kvalitativní i kvantitativní analýze a zároveň vhodné podmínky pro denaturační separaci biomolekul.

Cíle a přehled článku

Článek shrnuje principy a postupy vývoje metod IP-RP pro oligonukleotidy: od výběru kolony, optimalizace mobilní fáze a gradientu až po škálování analytického protokolu na preparativní úrovni. Představuje doporučení pro zvýšení rozlišení, stability a nákladové efektivity.

Použitá metodika a instrumentace

Metody využívají alkylaminové iontově párující činidlo (TEA, DBA, HA) v mobilních fázích pro UV a MS detekci. Typické podmínky:

• Mobilní fáze A: 100 mM alkylaminu (acetát/fluoroizopropanol) ve vodě, mobilní fáze B: acetonitril nebo methanol
• pH ≥ 7, teplota 60–80 °C
• Kolony: AdvanceBio Oligonucleotide (silika C18, 2.7–4 μm, 100 Å, 2.1–21.2 mm ID) a PLRP-S (polymer, 3–30 μm, 100–4 000 Å, 2.1–100 mm ID)
• Detekce: UV (254–260 nm) nebo ESI-MS
• Zařízení: Agilent 1260 Infinity II Prime LC
• Doplňky: Agilent Stay Safe Caps pro prodloužení životnosti mobilních fází, preparativní měřiče Agilent scaling calculator, AdvanceBio Spin Columns pro rychlé odstranění TEAA

Hlavní výsledky a diskuse

Studie ukázaly, že:

• Polymerové kolony PLRP-S odolávají vyšším teplotám (až 200 °C) a pH (1–14) a nabízejí delší životnost než silikagelové fáze.
• Optimální velikost pórů (≥ 3× hydrodynamický poloměr analyzátu) zvyšuje přenos hmoty a zlepšuje rozlišení.
• Menší částice v analytických kolónách (2.7–4 μm) dovolují vyšší efektivitu, ale vyžadují vyšší tlakové podmínky.
• Použití silnějšího iontově párujícího činidla (např. hexylamin) a jemnější gradienty (+0.2–0.3 %B/min) umožňuje dosáhnout separace n-1 krátkých kontaminantů s R > 2.
• Vysoké provozní teploty (60–80 °C) denaturují sekundární struktury, snižují viskozitu mobilní fáze a zlepšují šířku piků.
• Při preparativním škálování z analytického formátu na kolony s větším ID je možné udržet poměr částice, délka a gradientu s využitím matematických vzorců pro přenos průtoku, objemu injekce a doby běhu.

Přínosy a praktické využití metody

IP-RP HPLC umožňuje detailní kontrolu syntetických a biologicky získaných oligonukleotidů:

• V analytickém režimu zajišťuje spolehlivou kvantifikaci, selektivitu a opakovatelnost.
• V preparativním režimu nabízí vyváženost mezi čistotou, výtěžkem a průchodností, s možností rychlého odsolení a vzorkové přípravy Spin Columns.
• Kompatibilita s MS rozšiřuje možnosti identifikace modifikací a heterogenity.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• Superkritická mobilní fáze pro snížení spotřeby organiky a zrychlení metod.
• Nové iontově párující činidla šetrnější k MS a umožňující vyšší citlivost.
• Automatizované škálovací nástroje a AI-řízená optimalizace gradientů a podmínek.
• In-line odsolování a příprava vzorku pro kontinuální provoz a vysokopropustné screeningové platformy.

Závěr

IP-RP separace oligonukleotidů je univerzální technologie kombinující vysoké rozlišení, flexibilitu a škálovatelnost od analytické charakterizace až po preparativní purifikaci. Správnou volbou kolony, iontově párujícího činidla, gradientu a teploty lze dosáhnout cíleného zlepšení parametrů metody.

Reference

• Donegan M., Nguyen J. M., Gilar M. Effect of Ion-Pairing Reagent Hydrophobicity on Liquid Chromatography and Mass Spectrometry Analysis of Oligonucleotides. Journal of Chromatography A, 2022, 1666, 462860. DOI:10.1016/j.chroma.2022.462860.
• Guimaraes G. J., Saad J. G., Annavarapu V., Bartlett M. G. Mobile Phase Aging and Its Impact on Electrospray Ionization of Oligonucleotides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2023, 34(12), 2691–2699. DOI:10.1021/jasms.3c00264.