Analytical Solutions for High Throughput ADME Studies

Význam tématu

V raných fázích objevování léčiv je klíčové rychle a spolehlivě hodnotit farmakokinetické vlastnosti kandidátních sloučenin, zejména jejich absorpci, distribuci, metabolismus a vylučování (ADME). S rostoucím počtem syntetizovaných molekul ve screeningových knihovnách se stává limitujícím bodem tradiční analytická kapacita. Vysoce výkonné, automatizované metody LC-MS/MS s minimálním zásahem operátora usnadňují rozhodovací procesy a zkracují dobu od identifikace hitu k rozvoji preklinikálních kandidátů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat plně automatizovaný workflow pro vysoce propustné in vitro ADME testy, především mikrosomální stability, od automatické optimalizace hmotové spektrometrie, přes akvizici vzorků až po zpracování dat a reportování. Výzkum se zaměřil na integraci softwaru QuanOptimize v prostředí MassLynx s UPLC-ESI a tandemovým kvadrupólovým spektrometrem Xevo TQ-S micro a robotizovaným autosamplerem CTC PAL3 RSI.

Použitá metodika

Pro posouzení stability v jaterních mikrosomech potkanů (RLM) byly připraveny 96-jamkové incubace s konečnou proteinovou koncentrací 2 mg/mL a substrátovou koncentrací 1 µM. Vzorky se odebíraly v časech T0, T15, T30, T45, T60 a T90 minut a okamžitě zrážely chladným acetonitrilem. Po odstředění supernatanty prošly přímou injekcí na UPLC.
Chromatografie probíhala na CORTECS T3 1,6 µm (2,1×30 mm) s generickým gradientem vhodným pro retenci polárních i nepolárních analyzátů. MRM metody se generovaly automaticky po optimalizaci kuželového napětí a kolizní energie pomocí QuanOptimize na bypass kanálu.

Použitá instrumentace

• ULTRA-Performance Liquid Chromatograph (UPLC) s pumpou BSM (18 000 psi)
• Xevo TQ-S micro Tandem Quadrupole Mass Spectrometer se zdrojem ESI
• CTC PAL3 RSI autosampler s LCMS-P Tool a 100 µL Smart Syringe, vybavený modulem pro rychlé mytí
• Multikanálový column manager s bypass kanálem pro optimalizaci
• MassLynx Software a aplikace QuanOptimize pro úplnou automatizaci analytického workflow

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla vynikající přesnosti injekcí s RSD <2 % (n=6) pro všechny časové body mikrosomální inkubace u testovaných sloučenin. Automaticky generované MRM metody zajistily dostatečnou citlivost pro zachycení úzkých chromatografických špiček při vysokých průtocích. Profil stability nefazodonu a dalších kontrolních látek vykázal konzistentní křivky rozkladu (T0–T90), přičemž software zvládl kompletní proces od optimalizace po report s minimální obsluhou.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné urychlení optimalizace MS metod a akvizice dat
• Snížení rutinní práce operátora díky plné automatizaci
• Vysoká reprodukovatelnost a kvalita dat vhodná pro rozhodování v raných fázích vývoje léčiv
• Flexibilní správa vzorků a modifikovatelné režimy mytí pro minimální carry-over
• Možnost rychlé integrace do existujících ADME screeningových platforem

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj bude směřovat k využití strojového učení pro predikci ideálních MRM přechodů, integraci s LIMS a cloudovými platformami pro rychlé sdílení dat. Adaptace na vyšší propustnost a kombinační in vitro–in vivo korelace, implementace vysokorozlišovací MS pro identifikaci metabolit a rozšíření workflow na buňkově založené testy otevírají nové možnosti v preklinickém výzkumu.

Závěr

Prezentovaná metodika spojující UPLC-ESI, Xevo TQ-S micro, CTC PAL3 RSI a QuanOptimize představuje robustní, vysoce propustné řešení pro in vitro ADME screening. Automatizace kritických kroků šetří čas, snižuje riziko chyb a přispívá ke zrychlení rozhodovacích procesů ve vývoji nových léčiv.

Reference

• 1. Kassel DB. Applications of High-throughput ADME in Drug Discovery. Curr Opin Chem Biol. 2004;8(3):339–345.
• 2. Plumb RS et al. Addressing the Analytical Throughput Challenges in ADME Screening Using Rapid UPLC/MS/MS. Rapid Commun Mass Spectrom. 2008;22(14):2139–2152.
• 3. Shou WZ. Current Status and Future Directions of High-throughput ADME Screening in Drug Discovery. J Pharm Anal. 2020;10(3):201–208.
• 4. Jenkins KM et al. Automated High Throughput ADME Assays for Metabolic Stability and CYP450 Inhibition of Combinatorial Libraries. J Pharm Biomed Anal. 2004;34(5):989–1004.
• 5. Luippold AH et al. Integrated Platform for Fully Automated High-throughput LC-MS/MS Analysis of in vitro Metabolic Stability Samples. Int J Mass Spectrom. 2010;296(1):1–9.
• 6. Waters White Paper 720003442. Improving ADME Screening Productivity in Drug Discovery. 2010.
• 7. Tanna N. QuanOptimize: Rapid, Consistent, Accurate MRM Method Development for Small Molecules. Waters App Note 720007002. 2020.
• 8. CTC User Manual Edition 11.1. 2020.
• 9. Xu R et al. Application of Parallel LC/MS for High-throughput Microsomal Stability Screening. J Am Soc Mass Spectrom. 2002;13(2):155–165.