APPLICATION SOLUTIONS FOR METABOLITE IDENTIFICATION

Význam tématu

V klinickém a farmaceutickém výzkumu je rychlá a spolehlivá identifikace metabolitů klíčová pro hodnocení ADME (absorpce, distribuce, metabolismus, exkrece) vlastností nových léčiv. Pokrok v kapalinové chromatografii (UPLC) a hmotnostní spektrometrii (MS) spolu se specializovaným softwarovým zpracováním dat umožňuje výrazné zvýšení citlivosti, rozlišení a rychlosti analýzy. Tyto inovace usnadňují včasnou detekci farmakokinetických rizik a optimalizaci kandidátů na léky v raných fázích vývoje.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem souhrnu je představit integrovaná řešení pro identifikaci metabolitů založená na technologii UPLC, vysokorozlišovací TOF / Q-TOF MS, iontově-mobilní spektrometrii (IMS) a efektivní softwarové automatizaci. Text shrnuje aplikace včetně srovnání UPLC vs. HPLC, optimalizace scanovacích rychlostí, workflow s MS E, odstranění interferencí pomocí IMS, vyhledávání reaktivních metabolit, zvýšení citlivosti metodou Enhanced Duty Cycle, imaging MALDI-MS a chytré generování filtrů hmotových defektů.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Waters ACQUITY UPLC® se sub-2 µm kolonami (např. HSS T3, BEH C18), vysokoteplotní separace, gradientní eluční režimy.
• Spektrometrie: Waters SYNAPT™ HDMS™ a Q-Tof Premier pro TOF / Q-TOF analýzu s funkcí MS E (nízké a vysoké kolizní energie), Enhanced Duty Cycle (EDC) a iontovou mobilitou (IMS).
• MALDI imaging: MALDI Q-Tof Premier MS pro prostorové zobrazení distribuce diazepamu a metabolitu v mozkové tkáni.
• Softwarové nástroje: MassLynx™ s MetaboLynx™ XS pro automatickou detekci a zpracování metabolitů, MassFragment™ pro automatizované přiřazení fragmentů, DriftScope™ pro vizualizaci IMS dat.
• Biochemické přípravy: in vitro inkubace s jaterními mikrozomy, GSH pasti, odběry žluči a moči, příprava vzorků metodou proteinové precipitace a exaktní re-konstrukce roztoků.

Hlavní výsledky a diskuse

• Srovnání UPLC vs. HPLC: UPLC zkracuje dobu analýzy až 5×, zvyšuje rozlišení 1,6× a citlivost 5× při identifikaci protopanaxadiolu z žluče potkana.
• Rychlost scanu: SYNAPT HDMS udržuje vysoké spektrální rozlišení (~20 000 FWHM) i při rychlosti až 0,1 s/scan, což zajišťuje kvalitní chromatografická data.
• Iontově-mobilní spektrometrie: IMS odstraňuje PEG a endogenní interferenty, umožňuje čisté TIC prostoprostorové vyhledávání a TAP (CID–IMS–CID) fragmentaci poskytující sekundární i terciární fragmenty.
• MS E workflow: jednorázová TD-Funkce sbírá paralelně data o molekulách i fragmentech, umožňuje rychlé vyhledávání neutrálních ztrát a prekurzorových iontů včetně GSH konjugátů v pozitivním i negativním režimu.
• Enhanced Duty Cycle: vylepšená synchronizace iontových paketů s výtokem z pusheru TOF zvyšuje signál dále až 5× pro lepší detekci nízkoúrovňových GSH aduktů.
• MALDI imaging: lokalizace diazepamu a N-desmethyl-diazepamu v potkaní mozkové tkáni odhalila závislost distribuce na dávce a perfuzi, přičemž imaging koreluje s koncentracemi získanými LC/MS.
• Softwarová automatizace: MetaboLynx XS eliminuje většinu falešných pozitiv, generuje metabolické mapy, vypočítává poloviční život a rychlost vzniku metabolitů z jedné analýzy; MassFragment zefektivňuje strukturní potvrzení fragmentů.
• Inteligentní MDF: strukturově řízený generátor filtrů hmotového defektu umožňuje přizpůsobit MDF pro C–heteroatomové a heteroatomové štěpení, zvyšuje hit-rate Neočekávaných metabolitů.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zrychlení a zlevnění metabolitických studií v rané fázi vývoje léků.
• Vyšší rozlišení a citlivost analýz s menším objemem vzorku, méně falešných pozitiv.
• Integrované end-to-end workflow zkracuje dobu od data sběru po interpretaci a rozhodnutí.
• Možnost multiplexních screenů metabolitů, reaktivních meziproduktů a stability v jednom běhu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj iontové mobility pro oddělení izobarických metabolitů a stereoisomerů.
• Vylepšení algoritmů strojového učení pro automatizaci interpretace dat a predikci biotransformací.
• Rozšíření MS imaging technologií pro simultánní visualizaci více drog a biomarkerů v biopsiích.
• Integrace dat z několika experimentálních platforem (LC/MS, IMS, MALDI) do jednotného bioinformatického prostředí.

Závěr

Kombinace UPLC, TOF/Q-TOF MS s iontovou mobilitou a moderního softwaru pro datové zpracování umožňuje bezkonkurenční kvalitu a průchodnost metabolitických studií v rané fázi vývoje léčiv. Automatizované workflow s MS E, EDC, inteligentním MDF a pokročilou strukturní analýzou přináší rychlé, citlivé a přesné výsledky, které vedou k lepším rozhodnutím o optimalizaci kandidátů.

Reference

• Bateman KP et al. RCM. 2007;21(9):1485–96.
• Mortishire-Smith RJ et al. RCM. 2005;19(18):2597–602.
• Yu K et al. ASMS poster 2008;720002486EN.
• Castro-Perez J et al. RCM. 2005;19(6):843–8.