AUTOMATED LC/MS/MS HIGH THROUGHPUT MULTI-MODE IONIZATION QUANTIFICATION PROTOCOL APPLIED FOR MICROSOME STABILITY TEST IN DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT

Význam tématu

Metoda LC/MS/MS představuje klíčový nástroj pro screening in vitro metabolické stability v mikrozomálních testech, nezbytný v raných fázích vývoje léčiv. Vysoká propustnost a spolehlivost dat je základním předpokladem pro hodnocení ADME vlastností nových látek.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této práce bylo vyvinout plně automatizovaný, high-throughput analytický protokol od počátečního vývoje metody až po generování reportu, který využívá ESCi multi-mode ionizaci a UPLC separaci pro test stability v mikrozomech ve formátu 96 jamek.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byla použita Waters ACQUITY UPLC C18 BEH kolona (1,7 µm, 2,1×50 mm) s binárním přelivem 10 mM NH4OAc v ACN/H2O a ACN/MeOH. Měřicí systém tvořil Waters Micromass Quattro Premier triple-kvadrupól s ESCi multi-mode ionizačním zdrojem schopným střídat ESI a APCI v pozitivním i negativním režimu během jediné injekce.
Automatizaci řídil software MassLynx s aplikací QuanOptimize, která provádí sekvenční MS a MS/MS skeny, optimalizaci podmínek (konusová napětí, kolizní energie) a generuje MRM metody pro kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Byl dokázán provoz všech čtyř ionizačních režimů v jedné injekci, což významně snižuje počet potřebných analýz. Optimalizace zabírala obvykle 2 injekce na analyt (MS scan ve čtyřech režimech + MS/MS scan ve vybraném režimu). Z 46 testovaných sloučenin ~80 % vykazuje lepší citlivost v ESI, zbytek v APCI. Metodika umožnila analýzu 48 sloučenin na jednu UPLC běh a automatické vytvoření MRM metod.
U rychlého přepínání mezi režimy se mírně ztrácí počet datových bodů napříč chromatografickým píkem při velkém počtu kanálů, avšak pro primární screening estabilidady je to akceptovatelné.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení throughput screeningových testů metabolické stability
• Eliminace manuální výměny ionizačního zdroje a opakované optimalizace
• Plná automatizace vývoje MS/MS metod a reportingu
• Snadná integrace do rutinního provozu farmaceutických laboratoří

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření ESCi a obdobných multi-mode zdrojů do bioanalytických aplikací mimo mikrozomy, využití umělé inteligence pro dynamickou optimalizaci parametrů, aplikace v kombinaci s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry a další růst throughput.

Závěr

Byl vyvinut a validován plně automatizovaný vysokopropustný LC/MS/MS protokol pro in vitro mikrozomální stabilitu, využívající ESCi multi-mode ionizaci a UPLC separaci. Metoda minimalizuje čas analytika, maximalizuje počet analyzovaných látek a usnadňuje rutinní nasazení v rámci objevování a vývoje nových léčiv.

Reference

1. Di J, Biomolecular Screening. 2003;8:453.
2. Di L, Kerns E, J Pharm Sci. 2004;93:1537.
3. L. Di, E. Kerns, Curr Opin Chem Biol. 2003;7:402–408.
4. Balogh M, US patent WO 2003/102537.
5. Yu K et al., Poster Presentation, Montreux 2004.
6. Gale PJ, ASMS Quantification Training Class. 1999.