Multiplexed Targeted Imaging of Intact Proteins in Tissue by MALDI-IHC, on the SELECT™ SERIES MRT

Význam tématu

Analýza prostorové distribuce intact proteinů v tkáních hmotnostní spektrometrií přináší detailní molekulární informace o patologických i fyziologických procesech.
MALDI-IHC (imunohistochemie s foto-labilními peptidovými značkami) překonává omezení tradičního on-tissue digesčního přístupu i fluorescenčních metod díky vyšší multiplexaci a nižšímu pozadí auto-fluorescence.

Cíle a přehled studie / článku

Prezentovat kompatibilitu a výhody metody MALDI-IHC na hmotnostním spektrometru SELECT SERIES™ MRT.
Porovnat citlivost, selektivitu a kvalitu obrazů u vzorků lidské mandlové tkáně (6-plex validace) a clear cell renálního karcinomu (4-plex experiment).
Ověřit možnosti rozlišení markerů při různém prostorovém rozlišení (50 µm a 20 µm).

Použitá metodika

Deparafinizace a rehydratace FFPE řezů, antigen-retrieval a blokování nespecifického vázání.
Incubace s protilátkami opatřenými foto-labilními peptidovými značkami (PC-MT).
UV-záře k foto-uvolnění peptidových reporterů po dobu 10 minut.
Nástřik MALDI matrix (α-cyano-4-hydroxycinnamové kyseliny 10 mg/mL v 70:30 ACN/TFA) pomocí HTX™ M5.
Rekrystalizace ve vlhkostní komoře při 55 °C.

Použitá instrumentace

• Waters SELECT SERIES™ MRT MALDI-TOF/TOF s víceodrazovým TOF analyzátorem (mass resolution >200 000 FWHM, přesnost <500 ppb).
• HTX™ M5 Matrix Sprayer pro rovnoměrné nanesení matrix.
• AmberGen UV světelné pole pro foto-uvolňování značených peptidů.
• Waters High Definition Imaging (HDI™) Software pro vizualizaci a analýzu obrazových dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Validace na lidské mandli prokázala shodu lokalizace šesti markerů (Ki67, PanCK, kolagen-1A1, vimentin, CD68, CD3ε) s publikovanými daty.
V analýze renálního karcinomu byly lokalizovány čtyři proteiny (Actin-aSM, VIM, PanCK, Ki67) odděleně v benigní a nádorové tkáni.
Při rozlišení 20 µm byla pozorována možná buněčná úroveň detekce Ki67.
Velmi nízké pozadí signálu a vysoké rozlišení umožňují jasnou separaci reporterů od endogenních šumů.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost zobrazit více než 17 markerů v jednom vzorku bez spektrální interference.
• Vysoká citlivost a selektivita intact proteinů přímo v tkáňovém řezu.
• Využití ve výzkumu biomarkerů, patologie a farmakologie pro přesnou lokalizaci proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace MALDI-IHC do multi-OMICS studií pro simultánní analýzu lipidů, metabolitů a proteinů.
Rozšíření multiplexu nad 100 markerů díky přesné hmotnostní separaci.
Automatizace workflows a vyšší rozlišení pod 10 µm pro studium buněčných mikroprostředí.

Závěr

MALDI-IHC na SELECT SERIES™ MRT kombinuje vysokou prostorovou a molekulární přesnost s možností rozsáhlé multiplexace intact proteinů.
Metoda nabízí silný nástroj pro výzkum i klinickou diagnostiku, kde tradiční IHC i MSI narážejí na limity citlivosti a specifičnosti.

Reference

1. Yagnik G. et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2021, 32(4):977–988.
2. Lim M.J. et al. Front. Chem. 2023, 11:1182404.
3. Claes B.S.R. et al. Anal. Chem. 2023, 95(4):2329–2338.
4. Wang J. et al. Exp. Cell Res. 2006, 312(3):205–214.
5. Ridge K.M. et al. Genes Dev. 2022, 36(7-8):391–407.
6. Al-Maghrabi J. et al. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2020, 13(3):493–500.
7. Yang Y. et al. Oncol. Lett. 2013, 5(3):768–772.
8. Takagi M. et al. Genes Cells. 2016, 21:1113–1124.
9. Sobecki M. et al. Elife. 2016, 5:e13722.