MULTIPLEXED TARGETED IMAGING OF INTACT PROTEINS IN TISSUE BY MULTI REFLECTING TIME OF FLIGHT (MRT) MALDI-IHC

Význam tématu

Multiplexní zobrazování intactních proteinů v tkáních pomocí MALDI-IHC rozšiřuje možnosti prostorové analýzy protinádorových mikroprostředí a imunohistochemie. Metoda umožňuje simultánní detekci desítek proteinů na jednom řezu bez potřeby enzymatické digesce, čímž zachovává prostorovou distribuci a zvyšuje specifičnost oproti klasickým fluorescenčním metodám.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo demonstrovat výkonnost multiplexního MALDI-IHC na vysoce výkonném času letu MALDI spektrometru s multi-reflektorem (MRT). Autoři se zaměřili na validaci kvality obrazu, hmotnostní přesnost a rozlišení u lidských FFPE vzorků mandlí a ledviny s karcinomem.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byly použity:

• SELECT SERIES MRT MALDI spektrometr ve pozitivním ionizačním režimu, rozmezí m/z 50–2400, fixní čtvercový filtr 1000 Da, opakovací frekvence laseru 2 kHz.
• Pixelové velikosti snímání 50 µm a 20 µm s laserovým fokusem 4,0 mm a 5,8 mm.
• Pro štěpení peptidových štítků UV expozice před aplikací matrice CHCA nanášené HTX M5 sprayerem podle protokolu AmberGen HiPLEX-IHC.
• Software Waters HDI pro zpracování a vizualizaci obrazů.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve vzorcích mandlí i ledviny bylo dosaženo lokalizace protilátek na známých strukturách:

• Ki67 pro proliferační jádra.
• PanCK pro epiteliální buňky.
• VIM a Actin-aSM pro endotelové a hladké svalové buňky.

Na 20 µm rozlišení se signály izolovaly na jednotlivé pixely a mikrostruktury nádoru byly detailně zobrazeny. Hmotnostní přesnost nad 500 ppb a rozlišení >200 000 FWHM eliminovaly rušivé signály z endogenních iontů a minimalizovaly pozadí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Vysoce multiplexní zobrazování (>40 markerů) na jediném řezu.
• Úsporu času a materiálu díky eliminaci on-tissue digesce.
• Spolehlivou identifikaci proteinových peptidových štítků při nízkém pozadí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody ve prostorové proteomice a multiOMICS experimentech, integrace s genomickými a metabolomickými daty a vývoj nových peptidových štítků pro zvýšení počtu simultánně detekovaných cílů.

Závěr

Výsledky potvrzují, že SELECT SERIES MRT MALDI-IHC poskytuje vysoké hmotnostní rozlišení a přesnost při nízkém šumu, zajišťuje detailní prostorové mapování proteinů v FFPE sekcích a představuje robustní platformu pro další výzkum a klinické aplikace.

Reference

1. G. Yagnik et al.; J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2021, 32, 4, 977–988