SEC-MALS for mRNA Characterization with the Agilent 1260 Infinity II Multi-Angle Light Scattering Detector

Význam tématu

mRNA představuje klíčovou třídu biofarmaceutik, kterou akceleroval zejména vývoj vakcín proti COVID-19. Díky své složité a vysokomolekulární struktuře vyžaduje mRNA pokročilé analytické přístupy pro stanovení molekulové hmotnosti, struktury a úrovně agregátů, což jsou kritické kvality pro bezpečnost a účinnost léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace SEC-MALS (size exclusion chromatography – multi-angle light scattering) bylo demonstrovat schopnost stanovit molekulovou hmotnost monomeru mRNA i podíly agregátů. Studie využila kombinaci Agilent 1290 Infinity II Bio LC systému s Agilent 1260 Infinity II MALS detektorem a širokopórové kolony AdvanceBio SEC 1000Å.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika SEC-MALS umožňuje paralelní měření koncentrace (UV, RI) a rozptylového signálu podél chromatografické šarže. Pufr a vzorky byly připraveny v 150 mM fosfátovém pufru pH 7, filtrovány a uchovávány při kontrolované teplotě. Měření probíhala při průtoku 0,6 mL/min, teplotě kolony 30 °C a injekčním objemu 5–20 µL.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC System (pumpa, multisampler s termostatem, termostat kolony)
• Agilent 1290 Infinity II Refractive Index Detector
• Agilent 1290 Infinity II Variable Wavelength Detector (260 nm)
• Agilent 1260 Infinity II Multi-Angle Light Scattering Detector (20 úhlů)
• AdvanceBio SEC 1000Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 µm
• WinGPC software verze 1.0

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrace kolony provedena na rituximabu (monomer 145 kDa) pro ověření rozlišení agregátů.
• Analýza mRNA (4 546 nukleotidů) ukázala monomerovou špičku s MW 1 453 000 Da, v souladu s teoretickou hodnotou.
• Stanovení podílů: 74 % monomer, 20 % dimer, 6 % vyšší agregáty.
• Vysoká přesnost stanovení (RSD ~ 2 %) díky biokompatibilnímu průtokovému cestě a optimalizovanému zapojení detektorů (UV–MALS–RI).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a spolehlivá charakterizace mRNA monomeru a agregátů bez nutnosti rozsáhlé přípravy vzorku.
• Kompletně inertní, bezobsahová cesta vhodná pro agresivní pufry a citlivé biomolekuly.
• Uplatnění v kontrole kvality mRNA vakcín a terapeutik, v R&D i produkčních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj metodiky povede k integraci s hmotnostní spektrometrií pro detailní mapování modifikací RNA, k dalšímu zvyšování citlivosti detektorů a automatizaci přípravy vzorků. Očekává se také vývoj nových kolon s lepší separační kapacitou a pokročilé datové analýzy pro predikci stability a struktury.

Závěr

SEC-MALS v kombinaci s biokompatibilním bio LC systémem poskytuje přesná, reprodukovatelná data o molekulové hmotnosti a agregaci mRNA. Metoda podporuje vývoj i výrobní procesy moderních mRNA bioterapeutik.

Reference

1. Sahin U.; Karikó K.; Tuereci Ö. mRNA-Based Therapeutics—Developing a New Class of Drugs. Nat. Rev. Drug Discov. 2014, 13(10), 759–780.
2. USP-NF. Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality (Draft Guidelines), 2nd Edition, 2023.
3. De Vos J.; Morreel K.; Alvarez P.; Vanluchene H.; Vankeirsbilck R.; Sandra P.; Sandra K. Evaluation of Size-Exclusion Chromatography, Multi-Angle Light Scattering Detection and Mass Photometry for the Characterization of mRNA. J. Chromatogr. A 2024, 1719, 464756.
4. Held D. Tips & Tricks GPC/SEC: How to Determine dn/dc Values. The Column 2015, 10(7), 10–15.
5. Radke W. Tips & Tricks: New and Old Approaches to Handle Unknown dn/dc in GPC/SEC-LS. The Column 2017, 13(14), 19–23.
6. Advanced SEC-MALS Analysis of Monoclonal Antibodies with the Agilent 1260 Infinity II Multi-Angle Light Scattering Detector. Agilent Technologies Application Note 5994-7664EN, 2024.