Precise Determination of Protein Molecular Weight using the Agilent 1260 Infinity Multi-Detector GPC/SEC System

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) je klíčová metoda pro separaci biomolekul podle velikosti. Přesné stanovení molekulové hmotnosti, hydrodynamického poloměru a koncentrace proteinů je zásadní pro výzkum proteomiky, kontrolu kvality biopharmaceutik a analýzu mAb agregátů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem Application Note je ukázat rozšíření Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC systému o 1260 Infinity Multi-Detector GPC/SEC modul. Metoda kombinuje refraktometr, UV detektor, duální úhel světelného rozptylu a viskometr za účelem absolutního stanovení molekulové hmotnosti, velikosti a relativní koncentrace proteinů o hmotnostech 11–670 kDa.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC system (pumpa G5611A, autosampler G5667A, termostaty G1330B a G1316C)
• Agilent 1260 Infinity DAD VL s bio-inertním průtokovým kyvetovým článkem
• Agilent 1260 Infinity MDS RID (G7801A)
• Agilent 1260 Infinity MDS Viscometer (G7802A)
• Agilent 1260 Infinity MDS Dual Angle Light Scattering Detector (G7803A)
• 2× Agilent Bio SEC-3 kolony (300 Å, 7.8×300 mm, 3 µm), inline filtr 0.2 µm a Captiva Premium Syringe filtr
• Software Agilent GPC/SEC verze 1.2 s multi-detektor upgrade
• Mobilní fáze: PBS pH 7.4, LC-grade voda, průtok 0.8 mL/min

Použitá metodika

• Kolonová teplota 35 °C, autosampler 4 °C, injekce 10 µL, doba analýzy 20 min (jedna kolona) nebo 40 min (dvě kolony)
• Detekce: UV při 280 nm, RI, světelný rozptyl (15° a 90°), viskometrie – data sbírána při 1 Hz
• Kalibrace inter-detektorového zpoždění (IDD) i jednotlivých detektorů pomocí monomerního vrcholu BSA
• Výpočet molekulové hmotnosti (LS 90°), hydrodynamického poloměru (viskometrie) a koncentrace (UV/RI)

Hlavní výsledky a diskuse

• Oddělení BSA s vynikajícím poměrem signál/šum pro všechny detektory
• Analýza šesti referenčních proteinů (11–670 kDa) ukázala výbornou shodu experimentální molekulové hmotnosti s literaturou (R² = 1) a hydrodynamického poloměru (R² = 0,99)
• Detekce a relativní kvantifikace agregátů thyroglobulinu (dimer, tetramer a vyšší agregáty) s přesným stanovením jejich molekulových hmotností a procentuální koncentrace

Přínosy a praktické využití metody

• Absolutní stanovení molekulové hmotnosti bez rozsáhlé externí kalibrace
• Simultánní měření velikosti a koncentrace v jedné separaci
• Široký rozsah aplikace na proteiny 11–670 kDa
• Důležité pro QA/QC v biopharmaceutickém průmyslu, zejména pro analýzu mAb agregátů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Charakterizace složitějších biologických komplexů (mAb, ADC)
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní identifikaci
• Automatizované online-QC workflow
• Rozšíření počtu detekčních úhlů a vývoj pokročilých senzorů pro analýzu supermolekulárních struktur

Závěr

Tetra detekční konfigurace Agilent 1260 Infinity Multi-Detector GPC/SEC v kombinaci s Bio-inert Quaternary LC poskytuje rychlé a přesné stanovení molekulové hmotnosti, hydrodynamického poloměru a relativní koncentrace proteinových vzorků. Výsledky vykazují výbornou korelaci s literaturou a metoda je ideální pro komplexní charakterizaci proteinů.

Reference

• Agilent Technologies Inc., Application Note 5991-2884EN, 2015