Advanced SEC-MALS Analysis of Monoclonal Antibodies with the Agilent 1260 Infinity II Multi-Angle Light Scattering Detector

Význam tématu

Analýza formou chromatografie velikostní výlučivosti v kombinaci s detekcí vícekadrového rozptylu světla (SEC-MALS) představuje zásadní nástroj v biotechnologickém a farmaceutickém výzkumu. Umožňuje přesné stanovení absolutní molekulové hmotnosti monomerů a agregátů proteinů, odhaluje přítomnost degradovaných produktů a podporuje rozhodování v oblasti stability bioterapeutik během vývoje i kontroly kvality.

Cíle a přehled studie

Tento aplikační dokument demonstruje využití přístrojového uspořádání Agilent 1290 Infinity II Bio LC System v kombinaci s detektorem Agilent 1260 Infinity II Multi-Angle Light Scattering (MALS) pro charakterizaci monoklonálních protilátek (mAbs). Cílem je ukázat postup přípravy vzorků i pufru, optimalizaci podmínek SEC a získání spolehlivých výsledků molekulové hmotnosti a agregace na modelech BSA a skutečné mAb (rituximab – MabThera).

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit Agilent AdvanceBio SEC 300 Å sloupec (7,8 × 300 mm, 2,7 µm). Systém Agilent 1290 Infinity II Bio LC zahrnoval:

• Pumpu Bio Flexible Pump
• Multisampler s termostatem vzorků
• Multicolumn Thermostat Standard Flow s bio výměníkem
• Variabilní vlnový detektor (VWD) s bio mikroflow článkem

Detekci rozptylu zajišťoval Agilent 1260 Infinity II MALS detektor sledující světlo pod 20 různými úhly. Analytická data byla vyhodnocena v softwaru Agilent WinGPC. Pro přípravu mobile phase byl použit 150 mM fosfátový pufr při pH 7, který prošel trojnásobnou filtrací (0,2 μm) a sterilizačním filtrem 0,2 μm. Vzorky BSA a mAb byly naředěny na 20 mg/mL, respektive 10 mg/mL.
Parametry metody:

• Rychlost průtoku: 0,6 mL/min
• Objem injekce: 5–20 μL
• Teplota kolony: 30 °C, detekční články: 30 °C
• UV monitorování: 280 nm
• Chlazení autosampleru: 8 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrace a nastavení detektoru byly provedeny na monomeru BSA. Separace ukázala vynikající rozlišení mezi monomerem, dimerem, trimery až po vyšší agregáty. MALS signál vykazoval oproti UV významně vyšší citlivost pro velké makromolekuly, přičemž nejmenší a největší úhly detekce (12° a 164°) poskytly nejlepší citlivost pro vysokomolekulární agregáty. Při analýze rituximabu (MabThera) byla monomerická forma určena na 144 kDa s RSD 0,14 % v deseti po sobě následujících bězích. Současně byly rozpoznány dimerické a vyšší agregované formy a fragmenty s molekulovými hmotnostmi kolem 291,9 kDa, 341,2 kDa a fragmenty ~103,4 kDa.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda SEC-MALS nabízí:

• Přímé určení absolutní molekulové hmotnosti bez potřeby externí kalibrace
• Citlivou detekci a kvantifikaci agregátů i degradovaných fragmentů
• Kompatibilitu s bio-statěnými proudovými dráhami bez rizika kontaminace železem
• Možnost kontinuálního sledování 20 úhlů rozptylu pro vyšší přesnost

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření integrace SEC-MALS do automatizovaných platform pro vysokoprostorovou analýzu biologik, včetně kombinace s hyphenovanými detektory (např. online MS) a využití pokročilých datových algoritmů pro přesnější popis molekulárních konformer a interakcí. Dále se plánuje vývoj miniaturizovaných, mikrofluidních SEC-MALS systémů pro rychlé screeningové testy stability proteinů.

Závěr

Kombinace Agilent 1290 Infinity II Bio LC a 1260 Infinity II MALS detektoru poskytuje robustní a vysoce citlivou platformu pro SEC-MALS analýzu bioterapeutik. Výsledky ukazují vynikající rozlišení a přesnost stanovení molekulové hmotnosti monomerů, agregátů i fragmentů, což splňuje nároky regulatorních požadavků a interního QA/QC.

Reference

1. Narhi L. O. et al. Classification of Protein Aggregates. J. Pharm. Sci. 2012, 101(2): 493–498.
2. Light Scattering and Size Exclusion Chromatography in Biopharma. Agilent Technologies White Paper, 2023, publication 5994-6110EN.
3. Wagner C. et al. Biophysical Characterization of Adeno-Associated Virus Vectors Using Ion-Exchange Chromatography Coupled to Light Scattering Detectors. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23(21): 12715.
4. Van Bruijnsvoort M. et al. Retention Behaviour of Amylopectins in AF4 Studied by MALS Detection. J. Chromatogr. A 2001, 925(1–2): 171–182.
5. Flores-Ortiz L. F. et al. Physicochemical Properties of Rituximab. J. Liq. Chromatogr. R. T. 2014, 37(10): 1438–1452.