A Light Scattering Toolbox for Characterizing Transport Proteins and their Interactions

Význam tématu

Multi-úhlové rozptylování světla (MALS) a dynamické rozptylování světla (DLS) jsou klíčové pro měření absolutní molární hmotnosti a hydrodynamického poloměru transportních proteinů v roztoku. Tyto metody umožňují přímé vyhodnocení oligomerizace a interakcí proteinů s ligandy či detergenty, což je zásadní pro pochopení mechanismu transportu a regulace transmembránových a cytosolických domén.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku je představit sadu světelno-rozptylových technik – CG-MALS a SEC-MALS – včetně kombinace s UV a refraktometrickou (RI) detekcí, k analýze transportních proteinů a jejich komplexů s detergenty. Studie zahrnuje měření monomer-dimer rovnováhy rozpustné domény, kvantifikaci interakcí a struktury komplexů lipidových transportérů.

Použitá metodika a instrumentace

• CG-MALS: použití systému Calypso pro řízené gradienty složení vzorku, měření MALS a DLS v závislosti na koncentraci (3 µg/ml – 3 mg/ml)
• SEC-MALS: spojení chromatografie velikostí s MALS, UV a RI detekcí pro oddělení a stanovení molární hmotnosti proteinu a přidruženého detergentu
• DLS: měření hydrodynamického poloměru (Rh) ve stejném objemu vzorku
• Detekční techniky: multi-úhlové rozptylování (MALS), dynamické rozptylování (DLS), UV detektor, refraktometr (RI)
• Vypočet afinity (KD), stoichiometrie a polydisperzity pomocí analýzy kompozice-gradientních dat

Hlavní výsledky a diskuse

• Solubilní N-terminální doména transportéru se v CG-MALS ukázala v monomer-dimer rovnováze; mutace snížila afinitu z KD = 0,1 µM na KD = 0,8 µM bez vzniku vyšších oligomerů.
• SEC-MALS experimenty pro lipidové transportéry FadL (bakteriální) a YEB (kvasinkový) prokázaly rozdíly v molární hmotnosti komplexů s detergenty; například FadL: jádro 48 kDa, komplex 81 kDa, ~144 molekul detergentu, YEB: 62 kDa vs. 97 kDa, ~72 detergentních molekul.
• Kombinace LS, UV a RI umožnila oddělit příspěvek proteinu a detergentu k celkové molární hmotnosti a určit proteinový podíl v komplexu (60–64 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé stanovení absolutní molární hmotnosti bez potřeby kalibrace standardy.
• Detailní charakterizace oligomerizačních stavů a interakcí protein–ligand, kritické pro vývoj farmaceutik a studium transportních mechanismů.
• Možnost kvantifikace proteinu v komplexech s detergenty, zásadní pro analýzu transmembránových proteinů.
• Integrace s běžným HPLC zařízením pro flexibilní aplikace v QA/QC a výzkumných laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace CG-MALS a rozšíření škály gradientních experimentů pro vícenásobné složky a komplexní biologické vzorky.
• Integrace s mikrodialýzou a dalšími technikami pro studium dynamiky shlukování proteinů.
• Rozvoj kombinovaných metod (MALS-DLS-RI-UV) pro on-line monitorování stárnutí a stability proteinových komplexy.
• Využití ve vývoji konjugovaných proteinů, nanotechnologií a pokročilých terapeutických nosičů.

Závěr

Light scattering toolbox založený na CG-MALS a SEC-MALS poskytuje robustní přístup k charakterizaci transportních proteinů, jejich oligomerizaci a interakcím s ligandy či detergenty. Díky kombinaci detekčních metod je možné získat detailní informace o struktuře a termodynamice komplexů, což usnadňuje pokročilé výzkumné a průmyslové aplikace.

Reference

• Wyatt Technology Corporation, Sophia Kenrick & Michelle Chen. A Light Scattering Toolbox for Characterizing Transport Proteins and their Interactions. 2014.