PEG-Protein Interactions for Stable Formulations Studied by CG-MALS
Postery | | Wyatt Technology | WatersInstrumentace
Mnohé terapeutické proteiny, zejména protilátky, vykazují při koncentracích typických pro finální formulace (> 10 mg/mL) nespecifické samoodpuzování i sdružování. Tyto procesy negativně ovlivňují rozpustnost, stabilitu a viskozitu přípravků. Přídavek excipientu, který se preferenčně váže na povrch monomeru, může snížit vzájemné interakce protein–protein, zvýšit kolloidní stabilitu a umožnit přípravu vysoce koncentrovaných formulací.
Tato práce se zaměřuje na kvantifikaci nespecifických interakcí lysozymu a PEG v prostředí modelové formulace (PBS) v koncentracích typických pro bioterapeutika. Pomocí metody CG-MALS byly určeny osmózní virialní koeficienty, stechiometrie komplexů i disociační konstanty interakcí.
Metoda byla založena na Composition-Gradient Multi-Angle Static Light Scattering (CG-MALS), která umožňuje souběžné měření samointerakcí proteinu i hetero-interakcí s PEG v roztoku.
Lysozym se při pH 7,4 a fyziologickém složení soli reverzibilně sdružuje do homodimerů s disociační konstantou KD = 4,4 mM a kladným A2, což odráží sterické odpudivé síly. PEG samotný vykazuje čistě odpudivou interakci odpovídající vyloučenému objemu. Křížový virialní koeficient A11 = 1,6·10⁻⁴ mol·mL/g² je výrazně nižší než teoretické A11exc ≈ 2·10⁻³ mol·mL/g², což indikuje přitažlivost mezi PEG a lysozymem. PEG nekonstituuje komplexy s monomery lysozymu, ale vytváří slabě vázané 2:2 komplexy s dimery (KD ≈ 1 mM). Při koncentracích PEG do ~25 mg/mL dochází ke stabilizaci dimeru, při vyšších koncentracích nastává rychlá hetero-agregace pravděpodobně elektrostatického či dipólového původu.
CG-MALS poskytuje:
Studie prokázala, že PEG v nižších koncentracích stabilizuje lysozym dimery, zatímco vyšší koncentrace vedou k hetero-agregaci. CG-MALS se ukázala jako klíčový nástroj pro kvantitativní charakterizaci interakcí v koncentrovaných proteinových formulacích.
GPC/SEC, HPLC
ZaměřeníProteomika
VýrobceWaters
Souhrn
Význam tématu
Mnohé terapeutické proteiny, zejména protilátky, vykazují při koncentracích typických pro finální formulace (> 10 mg/mL) nespecifické samoodpuzování i sdružování. Tyto procesy negativně ovlivňují rozpustnost, stabilitu a viskozitu přípravků. Přídavek excipientu, který se preferenčně váže na povrch monomeru, může snížit vzájemné interakce protein–protein, zvýšit kolloidní stabilitu a umožnit přípravu vysoce koncentrovaných formulací.
Cíle a přehled studie
Tato práce se zaměřuje na kvantifikaci nespecifických interakcí lysozymu a PEG v prostředí modelové formulace (PBS) v koncentracích typických pro bioterapeutika. Pomocí metody CG-MALS byly určeny osmózní virialní koeficienty, stechiometrie komplexů i disociační konstanty interakcí.
Použitá metodika a instrumentace
Metoda byla založena na Composition-Gradient Multi-Angle Static Light Scattering (CG-MALS), která umožňuje souběžné měření samointerakcí proteinu i hetero-interakcí s PEG v roztoku.
- Wyatt DAWN HELEOS multi-angle static light scattering detector
- Wyatt Calypso II composition gradient system a software
- Optilab T-rEX dRI concentration detector
- Wyatt Möbiuζ pro elektrosforetickou světelnou disperzi
Hlavní výsledky a diskuse
Lysozym se při pH 7,4 a fyziologickém složení soli reverzibilně sdružuje do homodimerů s disociační konstantou KD = 4,4 mM a kladným A2, což odráží sterické odpudivé síly. PEG samotný vykazuje čistě odpudivou interakci odpovídající vyloučenému objemu. Křížový virialní koeficient A11 = 1,6·10⁻⁴ mol·mL/g² je výrazně nižší než teoretické A11exc ≈ 2·10⁻³ mol·mL/g², což indikuje přitažlivost mezi PEG a lysozymem. PEG nekonstituuje komplexy s monomery lysozymu, ale vytváří slabě vázané 2:2 komplexy s dimery (KD ≈ 1 mM). Při koncentracích PEG do ~25 mg/mL dochází ke stabilizaci dimeru, při vyšších koncentracích nastává rychlá hetero-agregace pravděpodobně elektrostatického či dipólového původu.
Přínosy a praktické využití metody
CG-MALS poskytuje:
- Label-free a immobilizaci nepotřebující analýzu
- Určení absolutní stechiometrie a afinity (KD) v rozsahu sub-nM až mM
- Simultánní vyhodnocení samosdružování i hetero-interakcí
- Možnost studia multivalentních komplexů a více proteinských systémů
Budoucí trendy a možnosti využití
- Optimalizace excipientů pro různé bioterapeutické proteiny
- Screening formulací a analýza stability v rané fázi vývoje
- Studium komplexních systémů (bispecifické protilátky, chimerické proteiny)
- Integrace CG-MALS s dalšími spektroskopickými a termodynamickými metodami
Závěr
Studie prokázala, že PEG v nižších koncentracích stabilizuje lysozym dimery, zatímco vyšší koncentrace vedou k hetero-agregaci. CG-MALS se ukázala jako klíčový nástroj pro kvantitativní charakterizaci interakcí v koncentrovaných proteinových formulacích.
Reference
- Furness RB et al. Biomaterials. 1998;15(16):1361–1369.
- Rawat P et al. Biochem Biophys Res Commun. 2010;398(3):---
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
Podobná PDF
Characterizing Protein–Protein Interactions via Static Light Scattering: Nonspecific Interactions
2009|Waters|Technické články
Volume 27, Number 2 Technical Article by Daniel Some, Elizabeth Hitchner, and Julia Ferullo Characterizing Protein–Protein Interactions via Static Light Scattering: Nonspecific Interactions T he quantitative characterization of nonspecific protein– protein interactions is essential in understanding basic biomolecular function as…
Klíčová slova
svc, svcvirial, virialmals, malscoefficients, coefficientscvc, cvccontinued, continuedintermolecular, intermolecularstatic, staticscattering, scatteringprotein, proteininteractions, interactionscharacterizing, characterizingcharacterization, characterizationlight, lightvia
Characterization of self-associating antibody solutions at high concentrations with CG-MALS
|Waters|Aplikace
A P P L I C AT I O N N O T E AN3009: Characterization of self-associating antibody solutions at high concentrations with CG-MALS Sophia Kenrick, Ph.D. and Daniel Some, Ph.D., Waters | Wyatt Technology Summary The characterization of…
Klíčová slova
mab, mabcalypso, calypsoisa, isamals, malsinteractions, interactionsantibody, antibodydimer, dimerassociation, associationintermolecular, intermolecularmol·ml, mol·mlself, selfdimerization, dimerizationvirial, virialattractive, attractiveviscosity
AN3002: Understanding antibody and viral glycoprotein interactions using CG-MALS Kathryn M. Hastie, Ph.D., and Erica Ollmann Saphire, Ph.D., The Scripps Research Institute Summary Viral glycoproteins are often the only antigen found on the viral surface and, as such, are key…
Klíčová slova
vgp, vgpmals, malscalypso, calypsoigg, iggmolar, molardimers, dimersassociation, associationaffinity, affinitybind, bindminidawn, minidawnscattering, scatteringdimer, dimerequilibrium, equilibriumviral, viralconjugate
A P P L I C AT I O N N O T E AN3008: Metacomplex Formation & Binding Affinity of Multivalent Binding Partners Sophia Kenrick, Ph.D. and Dan Some, Ph.D., Wyatt Technology Summary Multivalent binding plays a crucial role…
Klíčová slova
binding, bindingmultivalent, multivalentstoichiometries, stoichiometriesmals, malsscattering, scatteringcomplexes, complexescircles, circlesassociation, associationstreptavidin, streptavidinstoichiometry, stoichiometrybivalent, bivalentcomposition, compositionformation, formationcalypso, calypsohetero