Characterization of self-associating antibody solutions at high concentrations with CG-MALS

Význam tématu

Charakterizace intermolekulárních interakcí v koncentrovaných roztocích protilátek je nezbytná pro vývoj stabilních a dobře aplikovatelných bioléčiv. Samointerakce proteinů mohou vést ke zvýšené viskozitě a kolloidální nestabilitě formulací, což negativně ovlivňuje jejich podávání a skladování.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo kvantifikovat afinitu a stechiometrii samointerakcí tří monoklonálních protilátek (mAb A, B a C) ve vlastních formulacích. Analýza byla provedena pomocí kompozice-gradientní víceúhlové rozptylové metody (CG-MALS) za různých koncentrací až do ~150 mg/ml.

Použitá metodika a instrumentace

Automatizované CG-MALS měření:

• Systém Calypso® pro přípravu 8–9 koncentrací každé protilátky až do ~40 mg/ml.
• DAWN® MALS detektor pro měření víceúhlového světelného rozptylu.
• Optilab® dRI HC detektor pro refraktometrické stanovení koncentrace.
• Některé vysokokoncentrované vzorky (nad ~40 mg/ml) byly analyzovány manuálně v microCuvette s upraveným výkonem laseru DAWN.

Příprava vzorků: protilátky zředěné 2–5×, filtrovány na 0,02–0,2 µm, automatické dávkování a zastavení toku po dobu 60 s pro ustálení rovnováhy.

Hlavní výsledky a diskuse

• mAb A vykazovala pouze odpudivé interakce s druhým viriačním koeficientem A2 = 7,13×10⁻⁵ mol·mL/g², odpovídajícím modelu tvrdé koule bez atrakcí.
• mAb B a C prokázaly slabé monomer-dimerové asociace (Dimerization Kd = 280 µM resp. 400 µM) následované nekonečnou izodesmickou asociací dimerů (ISA Kd = 180 µM resp. 130 µM), což vedlo k tvorbě oligomerů až do velikosti ~6–10 jednotek.
• Distribuce oligomerů ukázala, že vyšší uskupení (>10) jsou zastoupeny méně než 1 % mol/mol a že u mAb C je patrná mírná kooperativita (ISA Kd < Dimerization Kd).
• Silnější atraktivní interakce korelovaly se zvýšenou viskozitou: mAb A ~3 cP, mAb B ~7 cP, mAb C ~13 cP při 100–150 mg/ml.

Přínosy a praktické využití metody

CG-MALS umožňuje měřit samointerakce potenciálních bioléčiv bez značkování a modifikací vzorku přímo ve formulaci. Výsledky pomáhají:

• Optimalizovat složení formulace pro minimalizaci viskozity.
• Predikovat stabilitu a chování protilátek při vysokých dávkách.
• Urychlit vývoj nových biotherapeutik s požadovanými farmaceutickými vlastnostmi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace CG-MALS s pokročilou statistikou a strojovým učením pro lepší predikci vzorců interakcí.
• Rozšíření aplikace na další typy proteinových léčiv a konjugátů (ADC, nanobody).
• Vývoj miniaturizovaných a vyšších výkonnostních rozptylových detektorů pro rychlejší screening formulací.

Závěr

Studie prokázala, že CG-MALS poskytuje komplexní vhled do mechanizmů samointerakcí protilátek v koncentrovaných roztocích. Kvantifikace atraktivních a odpudivých sil pomáhá vysvětlit odlišnou viskozitu a stabilitu tří analyzovaných monoklonálních protilátek a podporuje informované rozhodování při vývoji bioléčiv.

Reference

1. Minton AP. Static Light Scattering from Concentrated Protein Solutions, I: General Theory for Protein Mixtures and Application to Self-Associating Proteins. Biophys J. 2007;93:1321–1328.
2. Scherer TM, Liu J, Shire SJ, Minton AP. Intermolecular Interactions of IgG1 Monoclonal Antibodies at High Concentrations Characterized by Light Scattering. J Phys Chem B. 2010;114:12948–12957.
3. Some D, Kenrick S. Characterization of Protein-Protein Interactions via Static and Dynamic Light Scattering. In: Protein Interact. 2012. doi:10.5772/37240.
4. Yadav S, Liu J, Shire SJ, Kalonia DS. Specific interactions in high concentration antibody solutions resulting in high viscosity. J Pharm Sci. 2010;99:1152–1168.
5. Zehender F, Ziegler A, Schönfeld HJ, Seelig J. Thermodynamics of Protein Self-Association and Unfolding. The Case of Apolipoprotein A-I. Biochemistry. 2012;51:1269–1280.