Infrared Activation Enables Native Top-Down MS Analysis of Membrane Proteins and Protein Complexes

Význam tématu

Masová spektrometrie nativních membránových proteinů představuje klíčový nástroj pro studium struktury, sestavy proteinových komplexů a interakcí s lipidy či ligandy. Tradiční metody narážejí na obtíže při odstraňování detergentních micel a fragmentaci velkých nedenírovaných proteinů, což omezuje dosah top-down analýzy.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo ukázat, že infračervené (IR) aktivace iontů membránových proteinů v kvadrupólově lineárním iontovém pastu umožňuje:

• kontrolované odstranění detergentů (IRD),
• efektivní fragmentaci naturních komplexů pomocí IR multiphotonové disociace (IRMPD),
• komplementární elektronové štěpení prostřednictvím aktivovaného iontového přenosu elektronů (AI-ETD),
• zvýšení sekvenčního pokrytí surových membránových proteinů i jejich komplexů (AqpZ, AmtB, BAM komplex).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: tetramer aquaporinu Z (~99 kDa), trimer ammoniakového kanálu AmtB (~126 kDa) a 200 kDa BAM komplex.
Detergenty: tetraethyleneglykol monooctyl eter (C8E4) pro AqpZ a BAM, n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) pro AmtB.
Instrumentace: Thermo Scientific™ Orbitrap Eclipse™ Tribrid MS s integrovaným CO₂ laserem (10,6 µm) zaměřujícím infračervené fotony do kvadrupólového LIT.
Protokoly:

• IRD: optimalizace výkonu a doby IR ozáření pro demicelizaci při zachování nekovalentně vázaných ligandů,
• IRMPD: MS2 při rozlišení 120 000 a ~80 % potlačení prekurzoru,
• AI-ETD: kombinace ETD se současným IR ozářením pro potlačení ETnoD a zvýšení fragmentace.

Hlavní výsledky a diskuse

1) IRD spolehlivě uvolňuje naturní membránové proteiny z micel s možností jemné regulace energie, čímž chrání křehké ligandy.
2) IRMPD vykazuje výrazně vyšší sekvenční pokrytí než CID/HCD u naturně nabitých komplexů.
3) AI-ETD doplňuje IRMPD o c/z fragmenty a minimalizuje produkty bez disociace elektronem (ETnoD).
4) Kombinace IRMPD a AI-ETD vedla u AqpZ k téměř úplnému pokrytí sekvence, u AmtB k významnému, avšak o něco menšímu rozsahu kvůli nižším intenzitám fragmentů.
5) Aplikace na BAM komplex umožnila identifikaci jednotlivých podjednotek, jejich N-terminálních lipidových modifikací (diacyl glyceroly, C16/C18) i subkomplexů (BamABC, BamACE).

Přínosy a praktické využití metody

Metodika nabízí robustní přístup k top-down analýze velkých, nativních membránových proteinů a sestav. Umožňuje charakterizovat post-translační modifikace, vazby lipidů a nekovalentní interakce včetně vysokomolekulárních komplexů, což je klíčové pro strukturální biochemii, vývoj léčiv i QA/QC v biotechnologiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• zdokonalení izolace a udržení vysoce nabitých, hmotnostně vyšších iontů,
• kombinace vícenásobných dob IRMPD a AI-ETD k překrytí různých segmentů bílkovin,
• větší objem předběžných iontů (multi-fill) ke zvýšení intenzit fragmentů,
• rozšíření do rutinních aplikací ve farmaceutickém a biotechnologickém sektoru pro studium membránových receptorů a komplexních systémů.

Závěr

InfraČervené strategie (IRD, IRMPD, AI-ETD) představují univerzální a vysoce výkonný přístup pro nativní top-down hmotnostní spektrometrii membránových proteinů a jejich komplexů. Díky jemné regulaci energie a kombinaci fragmentačních způsobů umožňují detailní sekvenční pokrytí, identifikaci lipidových vazeb a modifikací i studium sestav velkých proteinových komplexů.

Reference

1. Laganowsky A. et al. Membrane proteins bind lipids selectively to modulate their structure and function. Nature 510(7503), 172–175 (2014).
2. Riley N. M. et al. Activated ion electron transfer dissociation for improved fragmentation of intact proteins. Anal. Chem. 87(14), 7109–7116 (2015).
3. Hinkle J. D. et al. Activated-Ion Electron Transfer Dissociation Enables Electron-Based Dissociation Following Proton Transfer Charge Reduction. ASMS 2020.
4. Earley L. et al. Front-end electron transfer dissociation: a new ionization source. Anal. Chem. 85(17), 8385–8390 (2013).