Confident material selection in liquid chromatography instrumentation: The meaning of inertness

Význam tématu

V moderní biochromatografii je klíčové minimalizovat interakce mezi analyty (oligonukleotidy, léčiva) a kovovými povrchy instrumentace. Nedostatečná inertnost materiálů vede k úbytku analyzovaných látek, špatné reprodukovatelnosti a možnému uvolňování kovových iontů do elučního proudu.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává chromatografickou odezvu dvou typů kolón s kovovými povrchy — standardní a organosiloxanem upravenou — v kombinaci s různými UHPLC systémy. Testovány byly 20–100 nukleotidů dlouhé fosforothioátové RNA při pH 10 a ssDNA při pH 8. Cílem bylo kvantifikovat vliv materiálů na plošné plochy kovových částí, uvolňování kovů a kvalitu špiček v UV a MS detekci.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolóny: BEH C18 (2,1×50 mm, 1,7 µm) vs. Oligonucleotide C18 Premier s organosiloxanovou úpravou
• Eluce PS RNA: 9,5 mM HFIP + 7,2 mM TEA (voda/methanol), gradient do 100 % B
• Eluce ssDNA: 5 mM TEA + 50 mM HFIP (voda)/acetonitril (25/75), izokratický režim
• Systémy: Thermo Vanquish Flex UHPLC, Waters Acquity Premier, obě s titaniovými pumpami a MP35N kapilárami
• Detekce: PDA (200–500 nm) a single-quad MS (APCI, negativní mód)
• Analýza povrchových ploch: výpočet na základě hmotnosti, objemu a porozity klíčových dílů (fritů, ventilů, kapilár)

Hlavní výsledky a diskuse

• Pro PS RNA (pH 10) byly plošné integrály shodné na obou typech kolón i systémech, což potvrzuje vysokou chemickou inertnost.
• Pro ssDNA (pH 8) byla průměrná plocha špiček stejná, avšak na organosiloxanové kolóně byla až o 10 % vyšší při prvních injekcích, což svědčí o saturaci kovových povrchů.
• Žádný systém nevykazoval významný carry-over v MS detekci.
• Analýza povrchových ploch ukázala, že největší příspěvek má eluentní láhev s titanovými frity (0,15 m2/frit), zatímco ostatní kovové komponenty dosahují řádově 10-3 m2.
• Eluční methanol bez vody způsobil uvolňování kovových iontů pouze z titanových fritů, nikoli z pump či kapilár.

Přínosy a praktické využití metody

• Volba organosiloxanem upravených kolón výrazně snižuje interakci s kovovým povrchem a zlepšuje reproducibilitu prvních injekcí.
• Výměna titanových fritů v eluentních lahvích za inertní materiály minimalizuje uvolňování kovů do eluční fáze.
• Postup umožňuje laboratořím optimalizovat poměr robustnosti a chemické inertnosti podle specifických aplikací (oligonukleotidy, farmaka).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj pokročilých povrchových úprav s vyšší odolností vůči širokému pH a organickým rozpouštědlům.
• Standardizace modelových testů pro hodnocení inertnosti v různých LC-MS konfiguracích.
• Integrace nových materiálů (keramiky, kompozitů) v kritických modulech pump a kapilár.
• Využití datově řízených přístupů k predikci interakcí mezi analytem a povrchy.

Závěr

Vyvážením mechanické robustnosti a chemické inertnosti dosáhli autoři optimálního výkonu pro biochromatografii oligonukleotidů. Organosiloxanové povrchy a inertní frity redukují interakce, zatímco titaniové komponenty zůstávají vhodné pro vysoce-tlakové UHPLC systémy. Doporučuje se pravidelná výměna kritických dílů a uvážlivá volba materiálů podle analyzovaných vzorků.

Reference

1. Fehrenbach T., Wiese S. Materials in HPLC and UHPLC – What to Use for Which Purpose In: The HPLC Expert II. Wiley-VCH, 2017.
2. Köhler D., Yang H., De Pra M. Automated, compliance-ready, intact mass confirmation of modified oligonucleotides using an LC-MS platform. Application Note 002270.
3. Gilar M., Li Z., MacLean J. Improved chromatographic analysis of oligonucleotides with Acquity Premier Oligonucleotide BEH C18 columns. Waters App. Note 720007012.
4. De Pra M. et al. Effects of titanium contamination caused by iron-free HPLC systems on peak shape and retention of chelating drugs. J. Chromatogr. A, 1611 (2020) 460619.