EasyPep Sample Preparation Technology for Rapid and Efficient Mass Spectrometry-based Proteomics

Význam tématu

Proteomika je klíčová pro pochopení funkce buněk, diagnózu onemocnění a vývoj léčiv. Kvalita a reprodukovatelnost analýzy masové spektrometrie závisí na standardizované a efektivní přípravě proteinových vzorků. Technologie EasyPep přináší jednotný přístup k odbourání variability, zkrácení doby zpracování a zajištění vysokého výtěžku peptidů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje rozšíření EasyPep technologie o tři formáty:

• Mini (10–100 µg proteinů, rychlé zpracování do 3 hodin)
• Maxi (0,5–2 mg proteinů, optimalizace analýzy post-translačních modifikací)
• 96-well (vysoký průtok a možnost automatizace)

Ukázána byla srovnatelná účinnost všech formátů napříč různými typy biologických vzorků a kompatibilita s TMT značením či fosfo-enrichmentem.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky (buněčné pelety, plazma, tkáně, kvasinky, E. coli, FFPE) prošly následujícími kroky:

• Lýza a redukce sítí disulfidů
• Alkylace cysteinů
• Enzymatická digestace směsí Trypsin/Lys-C
• Odstranění detergentů a solí pomocí EasyPep Mini/Maxi columns nebo 96-well filtrační desky
• Případné TMT značení a Fe-NTA fosfo-enrichment

LC-MS analýzy proběhly na systému Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 se sloupcem EASY-Spray C18 a spektrometru Q Exactive Plus. Data byly vyhodnoceny v Proteome Discoverer 2.4 (SEQUEST HT) proti databázím UniProt.

Hlavní výsledky a diskuse

• Všechny tři formáty EasyPep dosáhly srovnatelných počtů identifikovaných proteinů a peptidů s workflow trvajícím pod 4 hodiny.
• Kompatibilita s TMT značením prokázala >99% účinnost značení, 10–20% vyšší identifikační skóre a nízký podíl neúplných štěpení.
• Metoda funguje spolehlivě na lidských buňkách, plazmě/depletované plazmě, FFPE a čerstvých tkáních, kvasinkách i bakteriích s CVs <5 %.
• Fosfo-enrichment na Fe-NTA přinesl >95% selektivity fosfopeptidů v čase zpracování 3–5 hodin.

Přínosy a praktické využití metody

EasyPep poskytuje:

• Standardizované workflow s vysokou reprodukovatelností
• Víceformátové řešení od malých až po makroskopické vzorky
• Zkrácení doby přípravy na několik hodin
• Kompatibilitu s automatizací a vysokopropustnými platformami
• Bezproblémové začlenění TMT a fosfo-enrichments do jediné přípravné sady

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj se zaměří na:

• Dálší zkracování a automatizaci procesů v linkách robotických manipulátorů
• Integraci multi-omics analýz (metabolomika, lipidomika)
• Vylepšení protokolů pro složité modifikace (ubiquitination, glycosylation)
• Cloudové a AI-podpořené vyhodnocení dat ve skutečném čase

Závěr

EasyPep je univerzální, rychlá a vysoce reprodukovatelná technologie přípravy vzorků pro masovou spektrometrii. Nabízí jednotný protokol pro různé typy vzorků a podporuje moderní kvantitativní přístupy jako TMT a fosfo-enrichment s minimálními didukcemi v identifikaci a vysokou selektivitou.