Development of Mass Spectrometry Grade Membrane Protein Standard

Význam tématu

Membránové proteiny představují klíčové cíle pro vývoj léčiv a jejich analýza hraje zásadní roli ve strukturní biologii. Hmotnostní spektrometrie umožňuje detailní studium jejich struktury, avšak nároky na vhodné podmínky a vhodnou instrumentaci často vedou k neoptimálním výsledkům. Zavedení standardu ve formě masové spektrometrie grade Aquaporinu Z (AqpZ) usnadňuje ověření připravenosti systému před vlastními experimenty a minimalizuje ztrátu vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a charakterizovat standard AqpZ pro použití ve více módech MS analýzy membránových proteinů. Autoři prezentují optimalizovaný proces výroby, testování reprodukovatelnosti napříč laboratořemi a nastavení klíčových parametrů pro přímou infuzi, LC-nMS s on-line buffer exchange (OBE) a HDX-MS.

Použitá metodika a instrumentace

• Proteinová exprese v Escherichia coli, extrakce ultracentrifugací, IMAC a SEC na Superdex 200 column
• Buffer exchange do 0.05 % LDAO v 200 mM amonném acetátu, skladování při −80 °C
• nMS přímá infuze na Q Exactive UHMR (spray 1.4 kV, kapilára 300 °C, in-source trapping iST variující −10 až −140 V)
• Online buffer exchange LC-nMS na Vanquish Flex UHPLC s NativePac OBE-1 kolonkou a Q Exactive UHMR
• HDX-MS na Orbitrap Ascend Structural Biology Edition s NEP II/Pepsin kolonkou a řízeným quench protokolem

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizovaná purifikace poskytla AqpZ s čistotou 97.5 % podle SEC a >98 % tetramerního stavu v nativním MS
• Přímá infuze napříč dvěma laboratořemi prokázala reprodukovatelnost (>98 % tetrameru, CV <5 %)
• Nastavení iST: nízké napětí (−10 V) způsobuje šum z detergentu, vysoké (−140 V) vede k částečné disociaci; optimální střední hodnota (−100 V) zajišťuje vysoce rozlišená spektra bez narušení struktury
• LC-nMS OBE metoda nabízí vysokou propustnost analýzy membránových proteinů s přesným kvantifikováním tetrameru
• HDX-MS studie v detergentech C8E4 a LDAO potvrdila konzistenci s krystalovou strukturou AqpZ (PDB2ABM) a nativními MS výsledky
• Systémová způsobilost: kritéria pro LC (UV intenzita, tlak, šířka a tvar píku) a MS (intenzita, podíl tetrameru >85 %) zajišťují spolehlivost výsledků

Přínosy a praktické využití metody

• Standard AqpZ umožňuje předběžné ověření funkčnosti LC a MS, snižuje riziko ztráty vzorků
• Rychle odhalí problémy s údržbou a seřízením přístrojů
• Podporuje vývoj metod pro nativní MS a HDX-MS membránových proteinů
• Usnadňuje harmonizaci protokolů mezi různými laboratořemi

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření standardizace i na jiné membránové proteiny a komplexní receptorové komplexy
• Integrace automatizovaných on-line metod výměny pufrů a high-throughput screening
• Využití umělé inteligence pro optimalizaci parametrů i prediktivní údržbu
• Další vylepšení instrumentace pro vyšší rozlišení a citlivost

Závěr

Standard Aquaporin Z grade MS nabízí robustní nástroj pro ověření a ladění LC-MS systémů před analýzou membránových proteinů. Poskytuje konzistentní výsledky napříč metodami a laboratořemi, usnadňuje odhalování problémů a podporuje efektivní vývoj analytických protokolů.

Reference

1. Liu W, Jayasekera HS, Sanders JD, Zhang G, Viner R, Marty MT. Online Buffer Exchange Enables Automated Membrane Protein Analysis by Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2023 Nov 28;95(47):17212-17219.