Establishing a Decision Tree for Native Mass Spectrometry Analysis of Membrane Proteins in Complex Membrane Mimetics

Význam tématu

Membránové proteiny se podílejí na klíčových buněčných funkcích a tvoří přibližně 60 % farmaceutických cílů. Jejich analýza ve stavu co nejbližším nativnímu vyžaduje jemné prostředí mimetických systémů, které zachovávají jejich strukturu a funkci. Native mass spectrometry (nMS) nabízí rychlou a citlivou charakterizaci, avšak náročnost různých mimetik – detergentů, nanodisků a SMALP – vyžaduje promyšlený přístup.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vytvořit rozhodovací strom pro výběr vhodné strategie nMS analýzy membránových proteinů v komplexních mimetikách. Autoři demonstrovali kombinaci online buffer exchange-nMS (OBE-nMS) pro detergenty a nanodisky s metodami charge detection MS a proton transfer charge reduction (DIA-PTCR) pro SMALP. Studie zahrnuje různé typy membránových proteinů, včetně GPCR, transportérů a kanálů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byly využity tyto přístroje a techniky:

• Online buffer exchange-nMS s UHPLC Thermo Scientific Vanquish Flex, kolona NativePac OBE-1 a přímé napojení na Thermo Scientific Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap s ExD buňkou
• Direct Mass Technology mode: přímá infuze s Thermo Scientific Nanospray Flex a Q Exactive UHMR s ExD buňkou pro přesné stanovení molekulové hmotnosti
• DIA-PTCR: datově nezávislý sběr s proton transfer charge reduction na Thermo Scientific Orbitrap Ascend Tribrid

Hlavní výsledky a diskuse

1. Detergenty (OBE-nMS)

• Rychlé tříminutové screeningové rozlišení membránového proteinu od nevolatilních složek
• Optimalizace mobilní fáze: 200 mM ammonium-acetát (AmAc) pro základní profil a AmAc + LDAO pro redukci náboje
• Test GPCR: C8E4 vedlo ke ztrátě signálu, DDM způsobil vysoké pozadí, LDAO vykázal žádoucí charge reduction

2. Nanodisky (OBE-nMS)

• Při 200 mM AmAc zůstávají nanodisky neporušené, umožňují stanovit celkovou hmotnost (~240 kDa pro AqpZ či AmtB)
• Silnější desolvatace může částečně disociovat komplex na monomery scaffold proteinu

3. SMALP (charge detection MS a DIA-PTCR)

• Ensemble MS vykazuje široký m/z pás od 4 000 do 16 000
  
• Direct Mass Technology zobrazuje profil hmotností protein-SMALP komplexu, korelující s SEC-MALS
• DIA-PTCR odhaluje skryté nábojové stavy a usnadňuje dekonvoluci lipidové hmoty (rozmeze 700–750 Da)

4. Heterogenní GPCR komplexy (Direct Mass Technology)

• Dva různé dávky ukázaly odlišné složení komplexu (Gα, Gβγ, Nb35) s molekulovými hmotnostmi ~140–175 kDa
• Porovnání s cryo-EM potvrdilo platnost detekovaných stavů

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a automatizovaný screening membránových proteinů v různých mimetikách
• Minimální ztráty a vysoká věrnost nativního stavu analyzovaných komplexů
• Možnost volby vhodné analytické strategie podle molekulové hmotnosti a typu mimetika

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace nMS s dalšími strukturálními metodami (cryo-EM, NMR) pro komplexní charakterizaci
• Vývoj nových mimetických systémů a přizpůsobených mobilních fází
• Automatizace rozhodovacího stromu a adaptivní sběr dat v reálném čase

Závěr

Navržený rozhodovací strom kombinuje OBE-nMS, Direct Mass Technology a DIA-PTCR pro komplexní analýzu membránových proteinů v detergentech, nanodiscích a SMALP. Tento přístup zvyšuje rychlost, spolehlivost a rozšiřuje aplikovatelnost nativní hmotnostní spektrometrie v biochemickém a farmaceutickém výzkumu.