Rapid online buffer exchange - Solutions for high-throughput analysis of large biomolecules by native mass spectrometry

Význam tématu

Native mass spectrometry (nMS) se stala klíčovým nástrojem pro analýzu velkých biomolekul díky schopnosti zachovat nedisociované komplexy a detekovat je s vysokou citlivostí. Kritickým krokem je eliminace nevolatilních složek, což standardně vyžaduje časově náročnou offline výměnu pufru. Rychlá online buffer exchange (OBE) nMS přináší automatizované a vysokopropustné řešení pro screening proteinů, komplexů a lysátů v naturních podmínkách.

Cíle a přehled studie

Technická poznámka se zaměřuje na popis metodik OBE nMS a jejich implementaci na různých konfiguracích UHPLC systémů (dual pump, single pump se stříkačkovým pohonem, divert valve, microflow na RSLCnano). Cílem je ukázat rychlou (<5 min) a efektivní výměnu pufru přímo online a demonstrovat detekci intaktních biomolekul bez aduktů s nevolatilními solí.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci se používá krátká gelová chromatografie SEC (NativePac OBE-1, 2.1×50 mm, 80 Å) s mobilem 50–200 mM ammonium acetátu isokraticky při 50–100 µL/min. Konfigurace kolonových ventilů (2p6p) umožňuje přepínání mezi LOAD (protein do MS) a WASTE (soli do odpadu). Využívají se systémy Thermo Fisher Vanquish Flex UHPLC, UltiMate 3000 RSLCnano a hmotnostní spektrometr Q Exactive UHMR.

Hlavní výsledky a diskuse

Příklad analýzy 1 µg NIST mAb z PBS ilustruje odstranění solí a detekci několika glykoforem ve spektru bez solných aduktů. Proteiny nad 8 kDa elují ve void volume SEC sloupce, což umožňuje univerzální metodu bez potřeby úprav pro rozdílné velikosti biomolekul. Metoda je reprodukovatelná a robustní.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá kontrola kvality (<5 min) intaktních proteinů a komplexů
• Automatizace a vysoká propustnost pro screening vzorků
• Možnost analýzy neustálených proteinů a komplexů v MS přívětivých podmínkách

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace OBE nMS s linkovanými procesy purifikace a expresního screeningu, rozšíření na analýzu komplexních biologických matric (lyzáty, exosomy) a aplikace strojového učení pro optimalizaci metod a interpretaci spekter.

Závěr

Online buffer exchange v rámci nativity mass spectrometry představuje efektivní a rychlý přístup k analýze velkých biomolekul bez manuálních kroků výměny pufru. Metoda nabízí vysokou citlivost, robustnost a snadnou automatizaci, což ji činí vhodnou pro výzkum i QA/QC v biotechnologiích.

Použitá instrumentace

• Thermo Fisher Vanquish Flex UHPLC
• Thermo Fisher UltiMate 3000 RSLCnano
• NativePac OBE-1 SEC column, 2.1×50 mm, 80 Å
• Thermo Scientific Q Exactive UHMR MS
• Viper kapiláry a 2-position/6-port sloupový ventil

Reference

1. VanAernum ZL et al Rapid online buffer exchange for screening of proteins, protein complexes and cell lysates by native mass spectrometry Nat Protoc 2020 15 1132-1157
2. Liu W Zhang T Bechler S Viner R Rapid online buffer exchange for protein screening Thermo Fisher Scientific Application Note FL0170