Rapid monitoring of mAb aggregates during the purification process development of therapeutic mAbs using a modified Orbitrap hybrid MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují významnou třídu biologických léčiv, avšak tvorba proteinových agregátů během výroby a purifikace může negativně ovlivnit jejich účinnost a bezpečnost. Rychlá a spolehlivá detekce a kvantifikace agregátů je proto klíčová pro zajištění kvality konečného léčiva.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout metodiku kombinující chromatografii SEC s UV detekcí a intaktní hmotnostní spektrometrií (native intact mass) na Orbitrap Excedion Pro BioPharma MS pro přímé měření molekulové hmotnosti mAb agregátů a sledování jejich kvantitativních změn během fáze polish purifikace.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda zahrnovala separaci mAb a jejich agregátů pomocí size exclusion chromatography na systému Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC s kolonnou MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 µm) při 30 °C a průtoku 250 µl/min v 50 mM amonium acetátovém pufru. Detekce probíhala UV při 280 nm a intaktní hmotnostní analýza na Thermo Scientific Orbitrap Excedion Pro BioPharma MS v rozšířeném vysokomassovém rozsahu až m/z 12 000 s rozlišením 60 000 (m/z 200). Data zpracováno v BioPharma Finder 5.3.

Hlavní výsledky a diskuse

Při testu citlivosti a přesnosti byla použita tetramerní β-galaktosidáza (≈466 kDa), jejíž průměrná hmotnost (466 560 Da) potvrzuje vysokou citlivost a přesnost měření v rozšířeném rozsahu. V modelovém vzorku mAb1 bylo před polish purifikací detekováno 2,2 % vysokomolekulárních agregátů (dimery a větší). Po aplikaci POROS Caprylate mixed-mode cation exchange resin se agregáty zcela odstranily, což je doloženo absencí HMMS v chromatografii i MS.

Přínosy a praktické využití metody

Nová platforma SEC-UV-native intact mass umožňuje rychlé oddělení a přímou kvantifikaci mAb agregátů bez potřeby dodatečných odběhů či komplikovaných příprav vzorku. Metoda přináší vysokou citlivost, přesnost hmotnostní detekce a schopnost monitorovat purifikační proces v reálném čase.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření hmotnostního rozsahu a zlepšení rozlišení pro ještě větší biomolekuly. Integrace s automatizovanými purifikačními platformami a vývoj real-time datové analýzy podpoří rychlejší optimalizaci výrobních procesů mAb a dalších biologik.

Závěr

Popsaná LC-UV-native intact mass metoda pro Orbitrap Excedion Pro BioPharma MS prokázala efektivní separaci, detekci a kvantifikaci mAb agregátů v rámci purifikačního procesu a potvrdila vysokou účinnost POROS Caprylate polish resin při odstraňování agregátů.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC system
• Thermo Scientific MAbPac SEC-1 kolona (300 Å, 5 µm)
• UV detektor 280 nm
• Thermo Scientific Orbitrap Excedion Pro BioPharma mass spectrometer

Reference

• McGee JP, et al. Isotopic Resolution of Protein Complexes up to 466 kDa Using Individual Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 2021;93(5):2723–2727.