LC-MS-based host cell protein (HCP) identification and monitoring during biopharmaceutical downstream process development

Význam tématu

Host cell proteiny (HCP) představují klíčové nežádoucí kontaminanty v bioterapeuticích, které mohou negativně ovlivnit bezpečnost, účinnost a stabilitu finálního léčiva. Regulátoři (ICH, FDA, EMA) požadují důkladné sledování a validaci HCP clearance v průběhu downstream procesu. Tradiční ELISA poskytuje celkovou hladinu HCP, avšak nedokáže identifikovat a kvantifikovat jednotlivé proteiny, zejména neimunogenní.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ukázat výhodu využití LC-MS/MS metody pro kvalitativní a kvantitativní analýzu jednotlivých HCP během vývoje downstream procesu monoklonálních protilátek. Studie rovněž představila ucelené workflow od přípravy vzorku, přes vysokorozlišovací UHPLC-MS analýzu až po zpracování dat v softwaru BioPharma Finder.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation využil optimalizovanou ne-denaturační tryptickou digesci (2 h při 37 °C) za účelem omezení digesce mAb a zvýšení šance detekce nízkou hladinou přítomných HCP. Následovalo 1D separace na Vanquish Flex UHPLC kolonce Accucore C18 (2,1 × 250 mm, 2,2 μm) s lineárním gradientem 3–85 % acetonitrilu + 0,1 % FA při 0,3 mL/min. Detekce v režimu data-dependent Top10 na hybridním Q Exactive Plus Orbitrapu (HRAM). K řízení a zpracování dat sloužily Chromeleon CDS 7.2.10 s Biopharma QC balíčkem a BioPharma Finder 4.1 se zabudovaným HCP workflow.

Hlavní výsledky a diskuse

• Po Protein A kroku bylo identifikováno 676 HCP s celkovou úrovní ~49 473 ppm.
• Aniontová výměnná chromatografie (AEX) snížila počet HCP na 111 a hladinu na ~1 253 ppm.
• Kationtová výměnná chromatografie (CEX) byla nejúčinnější, redukovala HCP na 7 proteinů s celkovou úrovní ~90 ppm.
• Metoda umožnila cílené sledování tří vysoce rizikových HCP (peroxiredoxin-1, peroxiredoxin-2, fosfolipáza B-like) a kvantifikaci jejich clear‐ance až pod jednotky ppm.
• Systém vykázal vysokou reprodukovatelnost digesce (<10 % CV) a chromatografické separace.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní identifikace i relativní kvantifikace jednotlivých HCP v rámci jednoho LC-MS běhu.
• Podpora rozhodování při optimalizaci downstream procesu a validaci clearance vysoce rizikových HCP.
• Komplementární metoda k ELISA umožňuje zachytit i neimunogenní proteiny unikající imunoanalýzám.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace LC-MS HCP analýzy do standardních kontrol kvality (QC) bioprodukce.
• Vývoj automatizovaných online-/offline workflow pro kontinuální monitorování HCP během výroby.
• Rozšíření databází a AI-podporované datové analýzy pro rychlejší identifikaci nových rizikových proteinů.

Závěr

Optimalizovaný ne-denaturační LC-MS workflow v kombinaci s BioPharma Finder softwarem představuje robustní a citlivou metodu pro identifikaci, kvantifikaci a sledování jednotlivých HCP v bioterapeuticích. Umožňuje detailní mapování clearance rizikových kontaminantů a přispívá k rychlejší a cílené optimalizaci downstream procesu.

Reference

1. Walker DE, et al. MAbs. 2017;9(4):654–663.
2. Vanderlaan M, et al. Biotechnol. Prog. 2018;34(4):828–837.
3. ICH Q6B; ICH Q11.
4. FDA Guidelines for Host Cell Protein Analysis.
5. EMA Position Statement on HCP Impurities.
6. PMDA Guideline for HCP Testing.
7. Falkenberg H, et al. Biotechnol. Prog. 2019;35:e2788.
8. Huang L, et al. Anal. Chem. 2017;89(10):5436–5444.
9. Silva JC, et al. Mol. Cell. Proteomics. 2005;4(6):1487–1502.
10. Zhang Q, et al. mAbs. 2014;6(3):659–670.
11. Farrell A, et al. Anal. Chem. 2015;87(18):9186–9193.
12. Fischer SK, et al. AAPS J. 2017;19(1):254–263.
13. Lagassé HAD, et al. F1000Research. 2017;6:113.
14. Farrell A, et al. J. Proteome Res. 2014;13(7):3144–3159.
15. Hogwood CEM, et al. Curr. Opin. Biotechnol. 2014;30:153–160.
16. Rader C. Nature. 2015;518(7537):38–39.
17. Goey CH, et al. Biotechnol. Adv. 2019;36(4):1223–1237.
18. Gronemeyer P, et al. Bioengineering. 2014;1(4):188–212.
19. Valente KN, et al. Biotechnol. Bioeng. 2015;112(6):1232–1242.
20. Tscheliessnig AL, et al. Biotechnol. J. 2013;8(6):655–670.
21. Gilgunn S, et al. J. Chromatogr. A. 2019;1595:28–38.
22. Jawa V, et al. AAPS J. 2016;18(6):1439–1452.