Nano and Microscale Peptide Mapping by LC-UV-Orbitrap-Astral Detection of Monoclonal Antibodies with Fraction Collection for Detailed Analysis

Význam tématu

Mapování peptidů monoklonálních protilátek je klíčové pro ověření primární struktury, kvantifikaci posttranslačních modifikací a kontrolu kvality biotechnologických léčiv. Tradiční UV detekce poskytuje citlivé sledování kritických kvality definujících atributů, avšak spojení s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií umožňuje detailní analýzu i stopových komponent.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje nano- a mikro-LC separace tryptických digestů monoklonálních protilátek s integrovanou UV detekcí, frakčním odebíráním a Orbitrap Astral hmotnostní spektrometrií. Porovnává strategii řízenou výběrem iontů (DDA) a datově nezávislou analýzu (DIA), stanovuje limity detekce a ověřuje reprodukovatelnost odběru frakcí pro následnou podrobnou analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky protilátky Trastuzumab byly digesovány dvoufázově pomocí SMART Digest Trypsin na tepelně stabilizovaných nosičích za přítomnosti TCEP. Nanochromatografie probíhala na kolonkách PepMap Neo (75 µm × 15 cm) při 350 nL/min, mikrochromatografie na μPAC Neo (5,5 cm) při 1,25 µL/min nebo na C18 kolonce 1 mm × 15 cm při 50 µL/min. Analytický systém Thermo Fisher Vanquish Neo byl vybaven UV detektorem s 3 nL nebo 50 µm průtokovou cestou a integrovaným odebíráním frakcí. Mass spektrometr Orbitrap Astral pracoval v režimech DDA a DIA, nastavení: rozlišení FTMS 120 000, AGC 300 %, kolizní energie 30 NCE.

Hlavní výsledky a diskuse

Byly stanoveny limity detekce pro úplné mapování sekvence: mikroflow režim vyžadoval 70 pmol, nanoscale pouhých 80 fmol. V mikroflow režimu se do každé frakce shromažďovalo 15–22 µL, s průměrným RSD hmotnostních odběrů 5,9 %. Vrchol s nejnižší UV odpovědí (peptid EEQYNSTYYR) byl úspěšně zachycen a identifikován ve špičce chromatogramu. DIA a DDA poskytly srovnatelnou kvalitu mapování a kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje vysokou citlivost nano-LC s robustností mikro-LC a spolehlivostí UV detekce, doplněnou o detailní charakterizaci pomocí Orbitrap Astral. Lze ji aplikovat v QA/QC prostředí menších biotechnologických společností při sledování kritických kvality definujících atributů i stopových modifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozvoj drobnoformátových analytických sloupců s optimalizovanou geometrií pro zvýšení separační účinnosti při malých proudech. Vývoj automatizovaných modulů pro frakční odběr a pokročilých softwarových nástrojů pro DIA analýzu podpoří rychlejší a hloubkovou charakterizaci komplexních biologických vzorků. Integrace umělé inteligence pro interpretaci dat může dále zkrátit dobu analýzy a zvýšit úroveň standardizace.

Závěr

Studie potvrzuje, že nano- a mikro-LC-UV-Orbitrap-Astral metoda s frakčním odběrem umožňuje detailní mapování peptidů monoklonálních protilátek i při nízkých množstvích vzorku. Spojení DDA a DIA přináší flexibilní přístup k identifikaci a kvantifikaci kritických atributů a posttranslačních modifikací, což podporuje širší využití v biopharma QA/QC laboratořích.

Reference

1. Analytical Chemistry 2022, 94, 17195–17204
2. Analytical Chemistry 2015, 87, 7382–7388